RT-PCR反應注意事項

時間：2023/2/20閱讀：425

逆轉錄-聚合酶鏈反應 ( (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

反應注意事項：

1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

2．為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

3．內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。

5．防止DNA的污染：

① 采用DNA酶處理RNA樣品；

② 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

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