PCR反應被抑制或效率較低調整步驟

時間：2023/2/27閱讀：604

一旦確定反應被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調整到理想范圍內。

1、對于抑制作用，可去除模板濃度最高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下，則分析良好。

2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單，但在某些情況下，隨著分析復雜度的提高，優(yōu)化過程可能十分耗時費力。

4、擴增單個產物時，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率，但當出現(xiàn)競爭作用時，則應降低鎂的濃度。

5、在某些情況下(主要是多重反應中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質。此時，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時甚至還需檢測探針比值，以找出分析的理想濃度組合。最佳引物濃度介于100至600nM之間，而最佳探針濃度則在100nM至400nM 之間。

6、根據(jù)引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當，且引物設計時使之有相似的Tm 值。

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