對于研究豬干擾素誘導(dǎo)蛋白IP-10和Mx1克隆、表達及生物活性檢測說明

大鼠elisa試劑盒  ?研究表明,干擾素的眾多生物學(xué)功能是通過其誘導(dǎo)的多種效應(yīng)蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的。

為了進一步研究干擾素抗病毒機理和抗病毒重組生物藥物,本實驗選取干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中的兩個——IP-10蛋白和Mx1蛋白進行研究。

1.豬干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)的克隆表達及免疫活性檢測 為了研究重組豬IP-10蛋白的生物學(xué)功能和對疫苗免疫活性的影響,采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR的方法從豬脾臟組織中擴增豬IP-10基因,分別克隆到原核表達載體pGEX-6P-1和真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA。

將原核表達質(zhì)粒pGEX-IP-10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株DH5α中,并用IPTG于37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達,以純化的蛋白做免疫原免疫小鼠,制備出抗IP-10蛋白的陽性血清。將真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-IP-10轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞后,24h后經(jīng)間接免疫熒光(IFA)和免疫印跡(western blot)檢測IP-10的表達。

體外微室跨膜遷移實驗檢測HEK293T細胞表達的IP-10產(chǎn)物對脾淋巴細胞的趨化活性,并將有活性的蛋白作為佐劑和疫苗一起免疫動物,測定其對疫苗免疫的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果顯示,雙酶切鑒定和核酸序列分析證實pGEX-IP-10和pcDNA3.1-IP-10表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

免疫小鼠產(chǎn)生的陽性血清稀釋到1:10萬時A450的值大于未免疫小鼠血清的A450的值即P/N2.1,說明顯示免疫小鼠產(chǎn)生了抗豬IP-10蛋白的抗體即得到了抗IP-10蛋白的高免血清。真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,IFA能夠檢測到IP-10蛋白的表達,Western blotting顯示表達的融合蛋白分子量約為17KD。

體外微室跨膜遷移實驗和動物實驗證明重組IP-10蛋白對豬脾淋巴細胞具有趨化活性,且能產(chǎn)生一定的免疫增強作用。

2.豬Mx1基因的克隆與真核表達 根據(jù)已發(fā)表的Mx1蛋白的cDNA基因序列,設(shè)計一對特異性引物,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)從豬瘟弱毒疫苗和Poly:IC共刺激7小時的PK15細胞的總RNA中擴增出編碼Mx1蛋白的全長基因,并通過引物設(shè)計*PK15細胞系Mx1 cDNA序列中3’端缺失的11bp,成功獲得Mx1蛋白完整基因的克隆。

構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒pRetroQ-sMx1,轉(zhuǎn)染HEK293T細胞并表達Mx1蛋白,綠色熒光檢測和免疫印跡(western blot)檢測重組蛋白的表達,然后利用微量細胞病變抑制法測定其抗病毒活性。

結(jié)果顯示,雙酶切鑒定和核酸序列測定證實pRetroQ-sMx1真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞后,能夠檢測到綠色熒光,Western blotting證實為目的蛋白。微量細胞病變抑制法測定重組蛋白具有一定的抗VSV及PRRSV的活性。

結(jié)果表明,重組Mx1具有一定的抗病毒活性。

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