聚合酶鏈反應(PCR)一般操作步驟

聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外快速擴增特定基因或 DNA 序列的方法。

一般操作步驟：

1.反應體系與反應條件的選擇

現在市面上的商品化的 DNA 聚合酶有多種，里面也配備了相應的 Buffer，包含各種所需的催化離子與緩沖液的成分，實驗時只需要按照說明書加以稀釋并配制反應體系即可，有時也可以同等比例放大或縮小，需要說明的是同等比例的放大或縮小并不意味著實驗產物同等比例的縮放。

2.酶的選擇

早期的 PCR 擴增是由大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段完成的，但是這種酶不耐熱，每一個循環之后都需要加入新的酶。從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)中提取的 Taq DNA 聚合酶在較高溫度下依然保留活性，避免了繁瑣的操作，簡便了 PCR 的步驟?，F今，各個公司對酶的稱呼不一，很多經過 Taq 酶改造而來，也有其它來源的 DNA 聚合酶，建議綜合考慮保真性、擴增速度、操作簡便性、價格等衡量因素選擇合適的 DNA 聚合酶。此外，過高的溫度以及過長的時間對 DNA 聚合酶的活性都有影響。

3.循環參數的設定

依據實驗目的而定，一般的檢測質粒構建是否成功，20-24 個循環就可以；而對于構建過程獲得 PCR 產物來說一般 28-34 個循環左右。循環數太小，獲得的產物不夠，循環數太多浪費時間，產物的特異性也不一定好，不是循環數越多越好。

注意事項：

1.變性溫度不能過高，會影響酶的活性，變性溫度低，解鏈不全，導致引物不能結合，得不到擴增產物；

2.退火溫度與引物的 Tm 值有關；

3.依據實驗目的調整反應體系，使得 PCR 過程經濟、高效。