蛋白質免疫印跡(wb)的實驗步驟

Western blot（也稱為蛋白質免疫印跡）是一種常用于研究中分離和鑒定蛋白質的技術。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 來分離指定樣品中包含的各種蛋白質，然后將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素或 PVDF 膜上，接下來將膜與對感目標蛋白質的特異抗體一起孵育。在洗膜過程中，未結合的抗體被洗掉，只留下與目標蛋白質結合的抗體，最后通過顯影膠片或熒光掃描來檢測結合的抗體。

western blot的實驗步驟：
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。
1）轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。
6）轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時（或4℃過夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生物su的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內，于室溫下搖動1小時。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下搖動。

注意事項：
western blot中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態，空間結構改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物su化，再用酶標記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。