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    初級(jí)會(huì)員 | 第8年

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    標(biāo)準(zhǔn)的PCR三個(gè)基本反應(yīng)步驟

    時(shí)間:2022/7/18閱讀:2840
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    類(lèi)    似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復(fù)性)--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:

    1、模板DNA的變性(90℃-95℃):

    模板DNA經(jīng)加熱至90~95℃一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,雙鏈DNA在高溫作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。

    2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)(60℃-65℃):

    模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至50~60℃,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈。

    3、引物的延伸(70℃-75℃):

    DNA模板--引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。在Taq酶的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開(kāi)始以從5′到3′端的方向延伸,合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。




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