細胞冷凍保存步驟及注意要點

細胞冷凍保存

步驟：

1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。
2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。
3. 按細胞傳代培養(yǎng)操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液((約0.1 ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。
4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5x106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存。

6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于含異丙醇的程序降溫盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。

注意事項：

1. 欲冷凍保存的細胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。
2. 冷凍前檢測細胞仍保有其*性質(zhì)。
3.冷凍保護劑DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色，以5~10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。
4. 冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。