貼壁細胞培養技術貼：貼壁細胞傳代培養之*消化法

什么叫傳代細胞培養

是指細胞從一個培養瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養瓶的培養。
傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進行細胞傳代。貼壁生長的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進行傳代。
而這篇文章主要介紹的是貼壁細胞的傳代培養方法。

1、材料準備及實驗步驟
儀器：上海力康CO2培養箱、倒置顯微鏡、上海力康安全柜
材料：Corning細胞培養瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養的細胞。
試劑：培養基RPMI1640(Corning10-040-CVR)、胎牛血清、0.25%*、Hanks液(Corning 21-020-CVR)。
實驗步驟：
① 入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;
② 倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否傳代及細胞需要稀釋的倍數。 將培養用液37℃下預熱。
③ 超凈臺臺面應整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;
④ 打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面20min左右，關閉紫外燈，打開風機清潔空氣除去臭氧;
⑤ 點燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。
⑥ 將培養用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。
⑦ 倒掉細胞培養的舊培養基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養基，或用少量*涮洗一下。
⑧ 每個大培養瓶加入1ml*，小培養瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養瓶，使細胞脫離*，然后將*倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。
⑨ 加入少量的含血清的新鮮培養基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據分傳瓶數補加一定量的含血清的新鮮培養基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉，以利于CO2的進入，將培養瓶放回CO2培養箱。
⑩ 對懸浮培養細胞，步驟7-9不做。直接將細胞懸液進行離心去除舊培養基上清，加入新鮮培養基，然后分裝到各瓶中。
2、注意事項
① 傳代培養時注意無菌操作并防止細胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作。每種細胞使用一套器材。
② 每天觀察細胞形態，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。
③ 如發現細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養基反復清洗，隨后培養基中加入較大量的抗生素，并經常更換培養基。
3、傳代細胞的建系和維持
細胞系的維持通過換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來實現。
對每一個細胞培養系來說都有其自身的特點，要做好建系的維持必須記錄好細胞檔案,換液傳代和做好細胞系(或株)的鑒定和管理工作。