大鼠視網(wǎng)膜muller細胞永生化細胞操作注意事項

在操作大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞永生化細胞系時，需特別注意培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。實驗前需用75%酒精擦拭超凈工作臺，紫外線照射30分鐘以上，并提前預熱培養(yǎng)基至37℃。傳代時建議使用低濃度（0.05%-0.1%）進行短時消化，密切觀察細胞形態(tài)變化，當細胞邊緣開始回縮時立即加入含血清的培養(yǎng)基終止反應。

對于凍存與復蘇環(huán)節(jié)，推薦采用程序性降溫盒進行梯度凍存，凍存液中應包含10%DMSO和20%胎牛血清。復蘇時需快速解凍，37℃水浴中輕柔搖晃至冰晶消失后，立即轉移至預熱的培養(yǎng)基中離心去除凍存液。換液應在培養(yǎng)4-6小時后進行，避免頻繁移動培養(yǎng)瓶影響細胞貼壁。

在誘導分化實驗中，需特別注意血清濃度的梯度調整。建議從10%FBS的培養(yǎng)基逐步過渡到1%或無血清培養(yǎng)基，過程中每日觀察細胞形態(tài)變化。若出現(xiàn)異常空泡化或突觸回縮，應立即暫停實驗并檢測培養(yǎng)基滲透壓（正常范圍280-320 mOsm/kg）。

基因轉染操作推薦使用脂質體法，質粒濃度控制在1-2μg/μl，轉染后6小時需更換新鮮培養(yǎng)基以降低毒性。熒光標記后需設置未轉染對照組，避免自發(fā)熒光干擾結果判讀。所有操作均需在生物安全柜中進行，廢液須經(jīng)0.1%次氯酸鈉處理后再棄置。

定期進行支原體檢測（建議每月一次），若發(fā)現(xiàn)污染應立即隔離該批次細胞，并使用含5%CO?的加濕培養(yǎng)箱維持pH穩(wěn)定性。長期培養(yǎng)時需注意代次限制，建議在25代以內完成關鍵實驗，避免出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定性。