大鼠纖維母細(xì)胞；1/EJ 1-1復(fù)蘇操作流程

大鼠纖維母細(xì)胞；1/EJ 1-1復(fù)蘇操作流程：
 
1. 準(zhǔn)備工作，開水浴鍋，預(yù)熱試劑，超凈工作臺紫外照射 30min,找到對應(yīng)細(xì)胞在液氮罐中的位置
2. 紫外照射后風(fēng)機(jī)吹 10min 后，酒精擦拭臺面，放入試劑和離心管，取 15ml 離心管，加入 9ml 培養(yǎng)液
3. 在液氮罐中取出細(xì)胞，先擰松放液氮，再擰緊，將凍存管放入 PE 手套中，然后水浴融化后取出，1-2min
4. 將凍存管噴酒精后放入超凈臺內(nèi)，擦干管壁，用 1ml 頭將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已加培養(yǎng)液的離心管中
5. 800-1000rpm 離心 5min,注意配平
6. 將離心好的細(xì)胞棄上清，加入 5ml *培養(yǎng)基重懸，用移液管吹打 8-10 次， 避免產(chǎn)生氣泡，將細(xì)胞懸液接種到 10cm 培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加 5ml 培養(yǎng)液
7. 混勻，十字法或者 8 字法
8. 將混好的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 復(fù)蘇操作要點(diǎn)：
1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過zui易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。
3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。
5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。