胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）樣本的前處理

胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

① 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 NOX（此步可選做）。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于NOX活性測(cè)定。

血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1）試劑四于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五，混勻，記錄600nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

NOX 活力單位的計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NOX活力的計(jì)算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NOX活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A600變