細胞培養支原體直接培養法

ATCC細胞原理：直接培養支原體于培養基中，觀察其生長及菌落生成 
特點：是目Z直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。 
缺點：培養時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作正反應對照組，可能會造成污染。 
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horseserum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bactoagar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% 擦拭內壁。） 
培養基制備：基本配方為Difco PPLObroth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stocksolution (10%)。由于培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stocksolution或加入thallium acetate (1：2000)至培養基中以防止其它細菌污染。 
10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。 
液體培養基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15%yeast extract solution，及100ml解涷之10x stocksolution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1月。 
固體培養基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bactoagar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stocksolution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存于4℃，期限1個月。 
步驟： 
取1 mlATCC細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接于液體培養基中，置于37℃培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養周及二周后，分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。 
另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。 
另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。 
結果判讀： 
支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養1~2周增殖后，再培養于agar plate上。需至少培養3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。 
典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態（slime）。 
若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養于液體培養基中，培養一星期后再種入agar plate，若是ATCC細胞則不會生長。