ATCC細胞轉染實驗步驟

1、ATCC細胞傳代

(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。

(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止。

(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。

(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞*分散開。

(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

(7)用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。

(8)將合適體積*培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。

(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。

2、ATCC細胞轉染

(1)轉染試劑的準備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。

(2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。

(4)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

(5)加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

(6)到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入*培養基繼續培養24-48小時。

3、第二次ATCC細胞傳代

(1) 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

(2) 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新粉入培養皿中。

(3) 在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。