學者對于重組人β-防御素的表達和純化研究說明

elisa試劑盒人防御素(Human defensins)屬于抗菌肽家族,是人體內源免疫系統的重要組成部分。

人防御素具有廣泛的抗菌譜,而且致病微生物不易對它產生耐藥性,因此有很好的藥用前景。

本文建立在實驗室關于人B防御素2的成果基礎上,考察了人β防御素3(HBD3)和人β防御素4(HBD4)的表達條件,人β防御素4的分離和純化以及重組人β防御素4的抑菌活性。

本文利用進行了密碼子優化的人β防御素4表達菌種BL21(DE3)/pET32-smHBD4,考慮誘導溫度、誘導劑量、誘導時機、表達時間等因素,進行搖瓶發酵條件優化。

獲得優化培養條件:誘導溫度為34℃,IPTG量為0.4 mM,誘導時機為對數生長期中期,誘導后表達6hour終止。通過條件優化,目標蛋白融合蛋白TrxA—HBD4產量可達2.68g/l左右(即成熟的HBD4可達0.69g/l),目標融合蛋白占可溶蛋白65%左右。

隨后,文章對所得重組人β防御素4(HBD4)的分離純化工藝進行了探索,在經過Ni離子親和層析,腸激酶酶切,陽離子交換層析,凝膠脫鹽和冷凍干燥一系列處理后,獲得了純度為95%的重組HBD4,整個分離工藝流程回收率為53%。

接著,本文對重組HBD4的抑菌活性進行了考察,通過固體平板擴散法觀察到了重組HBD4對綠膿桿菌P.aeruginosa ATCC27853和大腸桿菌E.coli K12D31的抑菌活性;采用液體培養法,考察了重組HBD4濃度與其對大腸桿菌E.coli K12 D31的抑菌活性的關系,并繪制了殺菌曲線。

此外,論文還對人β防御素3的表達條件進行了優化,獲得優化條件:誘導溫度為34℃,IPTG量為0.4 mM,誘導時機為對數生長期中期,表達時間為8hour。

通過條件優化,目標蛋白融合蛋白TrxA—HBD3產量可達2.55g/l左右(即成熟的HBD3可達0.56g/l),目標融合蛋白占可溶蛋白66%左右。
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