細(xì)胞傳代培養(yǎng)具體過程

       當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層 (懸浮細(xì)胞會(huì)充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體過程：

一、傳代前準(zhǔn)備：

　　1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和yi 蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。

　　2.用75％酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。

　　3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

　　4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

　　5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。

　　6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

　　7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

　　8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

二、yi蛋白酶消化：

　　1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（yi蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。

　　2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

　　3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去yi蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

三、吹打分散細(xì)胞：

　　1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。

　　2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。

　　3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6～8分鐘。

　　4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

四、分裝稀釋細(xì)胞：

　　1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

　　2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。

五、繼續(xù)培養(yǎng)：

　　用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。

傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

　　1.嚴(yán)格的無菌操作

　　2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

　　附：EDTA（0.02％乙2胺四乙酸2鈉）消化液配方：

　　EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹di清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。