PCR模板變性溫度與引物退火溫度把控

    PCR又稱聚合酶鏈式反應，PCR的過程可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。關于熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物 之間的距離;距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度設置技巧分享。

1. 模板變性溫度

變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA 解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完、全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要;反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。

2. 引物退火溫度

退火溫度決定PCR特異性與產量;溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降;溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的最適退火溫度。也可根據引物的(G+C)%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分別表示相應堿基的個數。例如，20個堿基的引物，如果(G+C)%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時(如0.2μmol/L),退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。