感受態(tài)細(xì)胞制備原理及操作

     目前, 感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長的細(xì)菌,從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時細(xì)菌膨脹成球形,外源 DNA 分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收、轉(zhuǎn)化效率可達(dá)106-107轉(zhuǎn)化子/微克DNA。 

　　操作：

　　1.取-70℃冰凍菌種,用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿,做好標(biāo)記,于37℃培養(yǎng)過夜。

　　2.第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜.次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養(yǎng)基的500ml燒瓶中,37℃劇烈震蕩培養(yǎng)約2~3小時(200~300r/min)。

　　3.當(dāng)菌落600nm OD值達(dá)到0.3-0.4時,將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘.在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中.4℃,4000g離心10分鐘。

　　4.棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養(yǎng)液.加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中,振蕩混勻,懸浮菌體,冰浴30分鐘。

　　5.4℃,4000g離心10分鐘,棄上清,將管倒置于干濾紙上1min,吸干殘留的培養(yǎng)液.加4ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體.每管0.2ml分裝,至4℃保存?zhèn)溆?24-48小時內(nèi)使用效果較好.如果暫時不用,可再保存于-70℃的低溫冰箱中。