研究人員先將基因組DNA從人類細(xì)胞中提取出來(lái)

大鼠elisa試劑盒究腎臟形成的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，將S1P1基因缺失后，會(huì)威脅小鼠的生命，不是腎臟損傷，而是其他部位。“我們調(diào)查了影響腎血管系統(tǒng)發(fā)育中的基因的功能，”她回憶道。“心臟是首先發(fā)育的器官，所以我們刪除前體細(xì)胞中的這個(gè)基因后，心臟就出現(xiàn)了嚴(yán)重水腫、出血和低心率等異常。
一組研究人員利用一種短雙鏈寡核苷酸來(lái)標(biāo)記CRISPR-Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，測(cè)序這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，就能夠確定脫靶突變的位置。研究表明，就算某個(gè)脫靶突變的出現(xiàn)頻率低至0.1%，GUIDE-seq也能夠檢測(cè)得到。由于許多脫靶突變發(fā)生在與目標(biāo)位點(diǎn)差異很大的地方，因此脫靶DSB的數(shù)量和位置是很難預(yù)測(cè)的。
研究人員先將基因組DNA從人類細(xì)胞中提取出來(lái)，然后用多個(gè)sgRNA-Cas9組合進(jìn)行消化，zui后進(jìn)行全基因組測(cè)序。他們用一種新的DNA剪切評(píng)分系統(tǒng)，鑒定了Cas9在基因組中的剪切模式，即打靶和脫靶位點(diǎn)的特性。研究表明，轉(zhuǎn)錄自雙鏈寡核苷酸的sgRNA引起了許多脫靶事件，而轉(zhuǎn)錄自質(zhì)粒模板的sgRNA沒(méi)有這樣的問(wèn)題。多重化Digenome-seq可以捕捉到很多被其他方法漏掉的良性脫靶位點(diǎn)。研究人員還在此基礎(chǔ)上給出了減少CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)的指南。
研究人員在目標(biāo)切割位點(diǎn)的60 bp內(nèi)鑒定出成簇的IDLV整合位點(diǎn)（CLIS）。當(dāng)他們尋找WAS和TAT基因以外的CLIS時(shí)，在TALEN處理的細(xì)胞中未找到脫靶位點(diǎn)，而在CRISPR/Cas9核酸酶中發(fā)現(xiàn)一些。之后他們利用芯片預(yù)測(cè)和深度測(cè)序來(lái)確定IDLV分析的靈敏度，發(fā)現(xiàn)它能夠檢測(cè)頻率低至1%的脫靶切割。
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