大鼠elisa試劑盒的操作步驟復(fù)雜

大鼠elisa試劑盒的操作步驟復(fù)雜
影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。ELSIA試劑盒測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對(duì)數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是的檢測區(qū)域。
測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELSIA試劑盒測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線示例見圖4-2.注意圖中橫坐標(biāo)為對(duì)數(shù)關(guān)系，這更有利于測定系統(tǒng)的表達(dá)。1、 定性測定
定性測定的結(jié)果判斷是對(duì)受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的zui高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。
在間接法和夾心法ELSIA試劑盒中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。
（1） 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。
目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對(duì)照（P）、和陰性對(duì)照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。
a． 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
    用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對(duì)照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測而得到的。現(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml.每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測得A值后，先計(jì)算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)（NCX）和陽性對(duì)照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），ELSIA試劑盒試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對(duì)照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對(duì)照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算： 陽性判定值=NCX+0.05 標(biāo)本A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對(duì)各種試劑均可通用。