分享HRP標記抗體的方法

HRP標記抗體的方法
　　酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。戊二醛二步法
　　1.　原理：

  戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
　　2.　標記步驟：
　　(1)　稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。
　　(2)　反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
　　(3)　將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
　　(4)　用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。
　　(5)　加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
　　(6)　在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7)　3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
　　(8)　將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。