熒光素的選擇參考五個方面

在流式細胞術實驗，各種熒光素標記的抗體是必須的。那么熒光素該如何選擇呢，通常會參考以下5個方面：

1. 流式細胞儀配置：儀器需滿足激光管可激發相應的熒光素且可同時檢測所需的熒光。附常見熒光素的激發波長和發射波長：

2. 染料的亮度與抗原表達量相匹配：低表達抗原，推薦使用亮熒光染料；高表達抗原，推薦使用弱熒光染料。

3. 熒光染料重疊最小化：盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如FITC/PE-Cy7；選擇不同激光激發的熒光素，如FITC/APC，PE/APC。

光譜重疊嚴重的熒光素同時檢測會導致熒光溢漏，需調節補償。

4. 避免復合染料聯合使用帶來的假陽性：常見的復合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，復合染料的信號衰退會降低APC或PE的靈敏度。如果出現信號衰退，則：

1）、 減少樣本暴露于光、高溫或固定劑；

2）、選擇染料時考慮：復合染料的信號衰退會降低APC或PE的靈敏度，避免染料和其衍生物在同一細胞上標記。選擇更穩定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；

3）、 如果樣本需固定，選擇穩定、可有效阻止復合染料信號衰退的固定劑多聚甲醛：冰上固定10min，離心除去多聚甲醛，將樣品重懸于PBS中。

5. 盡量使用紅色激光激發自發熒光高的樣本：每種細胞群都有不同水平的自發熒光。所有的熒光通道均可觀察到自發熒光，但自發熒光強度在波長較長時迅速降低。對自發熒光較強的細胞，選擇紅光激發，發射波長長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值；對自發熒光比較弱的細胞，發射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善，可選用FITC。