流式細胞術（FCM）知識小課堂

FCM是利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數、快速的定性、定量分析或分析技術。然而，在FCM的實際應用過程中，要想得到高質量的流式數據卻并非易事。現就FCM實驗中的常見問題進行分析，希望能幫助相關實驗人員提高實驗成功率。

1. 怎么選擇合適的對照？
   1）同型對照：使用同型抗體做平行實驗，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。
   2）陰性細胞對照：使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是消除抗體的非特異性結合。
   3）二抗對照：第二抗體多為熒光標記的多抗，非特異性結合一般較高，可能造成基礎熒光值偏高，設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
   4）陽性對照：一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。
   5）空白對照：不進行任何標記的細胞，主要目的是用于測定基礎熒光信號表達值。

2. 收集的細胞通過流式儀檢測時，一般多少的細胞量合適？
   進行流式檢測時，至少需要記錄5000個活細胞，一般調整細胞密度至1*106/100ul進行流式檢測。

3. FCM檢測過程中如何設門（gating）？
   一般根據散射光進行設門，即我們通常所說的前散（forward scatter, FSC）和側散（side scatter, SSC）來設門。FSC的大小與細胞的直徑成正相關，不同的細胞，細胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細胞內顆粒結構的質量成正相關，不同的細胞，細胞內顆粒結構越復雜，質量越大，其SSC越大；反之越小。

4. FCM檢測過程中如何調節補償？
   在FCM檢測過程中，如果存在多色，則必須進行熒光補償調節。調節補償首先要知道雙陰性細胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下，才能既不會過多又不會過少地調節補償。

5. FCM檢測時，每次實驗的細胞數一定要相同嗎？
   FCM檢測時，若不進行細胞計數而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見，不同的細胞量會影響最終的實驗結果。因此，在準備樣本時，必須進行細胞計數，使每個分組及每次實驗的細胞數保持一致。

6. FCM檢測時，如果存在多色分析，應該如何進行配色呢？
   在FCM檢測過程中，如果存在多色分析，雖然可以通過熒光補償來消除熒光光譜重疊的影響。但調節補償過大在一定程度上仍然會影響測值的準確性，因此，我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。