平板克隆實驗具體過程

一、6孔板

1.將處于對數生長期的細胞胰酶消化后，*培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）重懸成細胞懸液，并計數；

2.細胞接種：于6孔板培養板中各實驗組接種400-1,000個細胞/孔（根據細胞生長情況確定，一般為700個細胞/孔）;

3.繼續培養到14天或絕大多數單個克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進行換液并觀察細胞狀態；

4.克隆完成后，在顯微鏡下對細胞進行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

5.每孔加入結晶紫染液1ml，染細胞10-20 min；

6.PBS 洗滌細胞數次，晾干，數碼相機拍照（分別對整個六孔板及每個孔進行單獨拍照）。

注意事項

1.每隔3天進行換液，在換液時，緩慢加入培養基，避免吹起細胞。

2.染色完成后，務必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。

二、平皿

1.取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在*培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）中備用。

2.將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組5個平行樣。每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。

3.置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2～3周。

4.當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6.去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%

注意事項

平板克隆形成實驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。

實驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

數據分析

顯微鏡下觀察陽性克隆，即每個克隆>50個細胞，相機拍照，數克隆數（大小約在0.3-1.0 mm）計算克隆形成率，并統計克隆大小。