滬鼎生物丨ELISA實驗小指南

酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。利用這種基于抗原抗體雜交的技術，我們可以量化檢測可溶性物質，如蛋白質，在ELISA中，抗原作為目標分子，被固定在（特定的固相載體上），并被特異性的，與酶偶聯的抗體檢測，當提供無色底物時，酶產生可測量的有色底物。

ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用范圍日益擴大。

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是血清學檢測方法，既可以檢測抗原也可以檢測抗體，主要包括間接ELISA、競爭ELISA、捕獲 ELISA以及雙抗夾心ELISA。其中，間接 ELISA操作相對簡便，結果清晰，在抗體的檢測中最為常用。該方法靈敏度高、特異性好，并且可以實現批量檢測，適合用于對臨床樣品的大批量檢測。

實驗步驟

間接法 - 常用于檢測抗體

（1）按實驗需求配置標準品，S0-S7；

（2）稀釋待測樣本和加樣；

（3）配置抗體，加樣，室溫孵育1-2h；

（4）配置洗滌液；

（5）洗板；

（6）配置辣根過氧化物酶標記親和素工作液（HRP）；

（7）3次洗滌結束后，加入稀釋后的 HRP 100L/孔，室溫孵育1h；

（8）洗板；

（9）加底物溶液；

（10）加終止液；

（11）加入終止液，使用酶標儀測定各孔吸光值（OD 值）。

注意事項

溫育是ELISA測定中最容易出現問題的步驟。溫育溫度應在37℃，水浴。溫育時間應按照試劑說明書上的時間嚴格執行。溫育實際測定操作中要注意以下幾點：

1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來。

2）因為采用水浴，所以在溫育時一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應孔內造成污染，并有可能整板花板。

全自動洗板機的使用應注意以下幾點：

1）洗板前，應檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶。

2）在自檢過程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。3）在洗板過程中，應注意觀察反應孔每孔是否灌滿且無外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時間。如果手工洗板的話就更需要操作者的操作技巧。

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