蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者,細胞內(nèi)的生理變化都是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的。但是生命活動中各項功能和行為不是由單一的蛋白質(zhì)來完成的,需要蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用來實現(xiàn)的。蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對調(diào)控細胞及其信號有重要意義。于是對于蛋白之間相互作用的研究也變的很重要,關(guān)于研究方法也是層出不窮。
一、原理:
酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立的。酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GL4有兩個獨立的結(jié)構(gòu)域 :N末端的DNA結(jié)合域(BD)和C末端的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。BD與DNA分子結(jié)合,AD激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,只有兩者在空間上充分接近才能激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。于是將要研究的兩個蛋白分別與BD和AD融合,如果兩個蛋白有相互作用則AD和BD在空間上會接近進而激活下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。
二、操作步驟:
(1)首先構(gòu)建已知蛋白的cDNA序列為誘餌,與DNA結(jié)合域融合
(2)將待篩選的蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合,構(gòu)建成文庫質(zhì)粒
(3)將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母細胞中
(4)通過檢測下游報告基因的表達篩選或確認蛋白相互作用。
三、優(yōu)缺點:
優(yōu)點:是可以在文庫中可以高通量篩選與目的蛋白相互作用的蛋白。
缺點:是假陽性多,還需要其他方法相互印證,不適用于所有的蛋白。
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