實驗室免疫血清制備方法

免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術。價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑(如用于制備免疫標記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體，?？色@得價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應予重視。

一、原理

具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外，抗體的產生具有回憶應答的規律性，表現為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應答特點截然不同。這是由于記憶性B細胞參與再次應答所致。

二、免疫方法

根據抗原的性質不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。

1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；

2.*次免疫：用2ml注射器吸取弗氏*佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml，每側腳掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內注入FCA-IgG，每個淋巴結注0.1ml，其余注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側窩及鼠蹊部皮下。

4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5~1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應達到1∶16以上時才能放血。

5.若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內注射免疫。即于1周內注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達到要求應立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不*佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。

三、放血

(一) 心臟采用血法

1.家兔仰面，四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；

2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；

3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動zui強的部位；

4.用50ml注射器(連接16號針頭)，傾針45°角度，對準心搏zui強處刺入心臟抽血致死；

5.將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。

(二) 頸動脈放血法

1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；

沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突??；

3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；

4.于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住；

5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；

6.松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。

四、分離血清

將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內3~4小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉，zui終濃度)，分裝后置4℃冰箱中保存備用。