分享---測培養細胞中污染的支原體

PCR法
原理 該法是通過PCR技術將支原體16srRNA基因特異性擴增，來檢測培養細胞中污染的支原體。PCR引物選自16sr RNA基因上的支原體特異片段，此片段與其他細菌的序列無交叉性雜交反應。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳，經溴乙啶（EB）染色后在紫外透射儀上進行檢測。
u  16sr DNA引物用水稀釋至40umol/L。
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
2）  PCR擴增
（1）  在冰浴中對各樣品制備PCR重要混合物，對每個樣品均加入：
10X PCR緩沖液 5.0ml
25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul
40umol/L 16sr DNA引物 每種引物1.0ul
40umol/L pBR322 DNA 引物 每種 2.0ul
pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul
DNA聚合酶（5U/ml） 0.2ul
三蒸水 35.4ul
總量 45ul
（2）  用無菌去離子水稀釋樣品為1:10，1:100。
（3）  于每個eppendorf管中加45ul PCR擴增混合物，每管中分別加入樣品原液及1:10，1:100稀釋液各5ul，操作均在冰浴中進行。
（4）  在每個eppendorf管中輕輕加入50ul無菌礦物油，覆蓋在液面上。如DNA擴增儀帶有有制式熱蓋，此步驟可省略。
（5）  將各管放入DNA擴增儀的孔槽內，并執行以下循環指令：
①  950C 10min 一個循環
②  950C，30S→580C 1min→720C 1min, 共30個循環。
③  zui后720C 10min延長循環。

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