在基于gⅥ的展示載體中克隆cDNA文庫(kù)

1 ．利用PCR從預(yù)制的丸GTll文庫(kù)中制備cDNA插入片段：pG6質(zhì)粒是為帶有多聚T核苷酸的cDNA進(jìn)行方向性克隆而設(shè)計(jì)的。利用帶有各自閱讀框的三個(gè)載體，每個(gè)cDNA都有可能被正確翻譯，直到核糖體遇到終止密碼子。考慮到許多蛋白分子的裝配，采用隨機(jī)引物法來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)可能對(duì)克隆相互作用更適合。事實(shí)上，不是全長(zhǎng)蛋白而是功能區(qū)，特別是細(xì)胞質(zhì)的功能區(qū)對(duì)無(wú)毒性的及作為pⅥ融合的表達(dá)起著更重要的作用。然而，在理想條件下，在這些載體中對(duì)用隨機(jī)引物法構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行克隆必須要求在每個(gè)載體的N021位點(diǎn)后，在每個(gè)閱讀框內(nèi)有翻譯終止子的引導(dǎo)區(qū)。而且，只有50%的轉(zhuǎn)化子在正確的表達(dá)位點(diǎn)上包含了cDNA 片段。

利用PCR從已制備的cDNA文庫(kù)中制備大量的cDNA 片段，用來(lái)構(gòu)建gⅥ-cDNA噬菌體顆粒文庫(kù)。盡管描述了從一個(gè)已制備的、SfiI-NotIλ入GTll方向性克隆的cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增的cDNA 片段，但是這更適合于從使用適當(dāng)載體引物的其他文庫(kù)中擴(kuò)增cDNA 片段，這個(gè)引物包含了酶SfiI和酶NotI的限制位點(diǎn)。建立一個(gè)大容量的gⅥ-cDNA文庫(kù)需要有十個(gè)同一的PCR反應(yīng)。盡管提供一個(gè)特殊的方法很難，但從經(jīng)驗(yàn)上來(lái)說(shuō)，哺乳動(dòng)物的cDNA文庫(kù)由5×105～1×106個(gè)獨(dú)立的克隆組成，從系統(tǒng)學(xué)上說(shuō)，這些克隆至少包含每個(gè)mRNA的一個(gè)拷貝。模板cDNA文庫(kù)應(yīng)該如實(shí)地把序列、序列大小以及產(chǎn)生它的mRNA數(shù)量的復(fù)雜程度呈現(xiàn)出來(lái)，這是很重要的一面。為了增加DNA合成的保真度，我們*使用具有3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

擴(kuò)增的DNA純化后，用Sfi和NotI進(jìn)行消化，除去小片段的cDNA，用0．8%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離消化的cDNA 片段。另一方面，這些短的片段選擇性地插入到文庫(kù)中，并減少文庫(kù)中長(zhǎng)cDNA克隆基因的數(shù)量。從瓊脂糖薄片上純化DNA并借用商業(yè)可行的系統(tǒng)可以恢復(fù)和濃縮靶cDNA（大小在500～3000bp）。

2．連接與轉(zhuǎn)化：擴(kuò)增的cDNA 片段連接到pG6質(zhì)粒上，為了確定優(yōu)化條件，在腳注中描述了連接測(cè)試。另外，為了增加轉(zhuǎn)化效率，建議純化連接混合物。近年來(lái)，電轉(zhuǎn)化法是將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中有效的方法。

3．gⅥ-cDNA文庫(kù)的評(píng)價(jià)及保存
為了確保在eDNA文庫(kù)重建過(guò)程中篩選出來(lái)的陰性結(jié)果不是由技術(shù)失誤造成的，因此檢驗(yàn)文庫(kù)的質(zhì)量是十分有必要的，建議要決定好獨(dú)立文庫(kù)克隆的數(shù)量、片段基因克隆的比例、片段平均長(zhǎng)度及它的長(zhǎng)度范圍。更加嚴(yán)格的質(zhì)量控制的方法是隨機(jī)抽取10個(gè)克隆，對(duì)每個(gè)cDNA片段從5’端至3’端測(cè)序，然后利用BLASTN數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分析獲得的序列。