熒光標記多肽的生物分布

         在有偶合劑（coupling reagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I （fluorescein isothiocyanate isomer 1） （Sigma）或若丹明B（Sigma），我們以此作為多肽固相合成的后一步，以N端標記了異硫氰酸熒光素（FITC）或若丹明的偶聯體的形式合成篩選出多肽。

我們通常用100ul的lmmol/L多肽PBS溶液注射一只鼠；然而佳濃度必須要經驗性地測定。例如，lmmol/L1000Da的多肽溶液是lmg/ml，而注射lOOul此溶液是總共100ug或lOOnmol的多肽。每只鼠大約有2ml的循環血液，因此得到的多肽濃度是100nmol/2m1或50umol/L，在這些多肽預期的親和性常數范圍之內。

對這些實驗的對照多肽是熒光標記的點突變多肽或一個多肽的失真譯本。可替代地，一個合適的對照是一段FITC或若丹明標記的NSSSVDK多肽：通過非重組T7Select415噬菌體展示的序列。

熒光標記能使多肽疏水性更強并難以直接溶解于水中。如果是這樣，將多肽加入少量的100％DMSO溶液中（如：100mg/ml），然后緩慢加入1XPBS或MilliQ水，直到多肽濃度為1mg/ml；也可以通過使用較低的多肽濃度、適度的加熱、超聲波降解及攪拌來提高溶解性。在相同條件下制備對照多肽。為了在不需要額外的抗體染色的情況下使血管顯現，我們注射FITC標記的（對于若丹明多肽）或*連接的番茄凝集素（tomatolectin），并以Streptavidin-Alexa Fluor 594作為次級反應物（對于FITC標記的多肽）。