轉移到麥芽糖結合蛋白中分析

          如我們以前的論文所述，我們經常將后幾輪篩選得到的序列轉移到能與大腸桿菌麥芽糖結合蛋白（MBP）融合表達的載體中去。這樣就能夠通過ELISA反應進行檢測（反應信號的強度通常與每個克隆所編碼的肽段的親和力相關）。并且，通過此法能夠輕易地純化毫克級的融合蛋白，這樣在化學合成肽段之前，就可以對很多肽段的性質進行初始分析。

通過對富集的質粒使用BspEI和ScaI雙酶切，然后將片段轉移到pELM3或pELM5其中的一個MBP載體中，就可以完成到MBP載體的轉移Ds]。為使庫片段更容易純化，上述酶切產物再通過NheI酶切，以防止隨機序列與片段共同轉移。約900bp的庫片段純化后，被連接到約5．6kb的pELM3或pELM5片段的AgeI與ScaI位點之間。通過轉化ARl 814大腸桿菌，可以得到單個克隆用以ELISA反應分析或者通過標記的受體進行克隆黏附的分析。

麥芽糖結合蛋白ELISA的方法與以前論文所述一致[1Sj，除了從大腸桿菌中釋放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我們發現，使用商業性的去垢劑（Pierce公司的B-PER抽提試劑）較*能更簡單有效地裂解細菌細胞。3 ml培養基中的經誘導的細胞先通過沉降，再通過含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重懸。于室溫下放置20分鐘后，離心5分鐘以除去細胞碎片，將上清轉移到一個新的管中。裂解物于一70~0凍存，當用于ELISA反應時按1：50稀釋。

在幾個實驗項目中，我們發現麥芽糖結合蛋白ELISA反應中的強信號經常能夠代表肽段與所研究的受體的高親和性。當然，對于嚴格的分析肽段的性質而言，終的化學合成肽段是必要的。如果是大規模的篩選克隆，先采用標準步驟進行克隆黏附分析，可以為后面的ELISA分析提供更少的克隆集合。
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