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在Liberty BlueTM自動(dòng)化微波肽合成儀上，可以輕松進(jìn)行Glu(OAllyl)的正交脫保護(hù)和通過內(nèi)酰胺化實(shí)現(xiàn)的肽環(huán)化。成功合成了HIV-1抗體表位gp41659-671和Afamelanotide的分支及內(nèi)酰胺環(huán)化變體。四種肽的純度均在80%到87%之間，每次合成僅需3到3.5小時(shí)，且僅產(chǎn)生700到750 mL的總廢物。
二、引言
肽鏈側(cè)鏈官能團(tuán)化技術(shù)，如生物偶聯(lián)、分支和環(huán)化，是藥物開發(fā)、醫(yī)學(xué)成像、材料研究等領(lǐng)域中不可或缶夬的重要工具。1-4許多氨基酸殘基都可以作為側(cè)鏈官能團(tuán)化的位點(diǎn)，其中就包括谷氨酉夋。
為了順利實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈官能團(tuán)化，必須為相關(guān)殘基配備適當(dāng)?shù)恼槐Ｗo(hù)基，該保護(hù)基能夠在肽鏈其余部分不受影響的情況下容易地進(jìn)行選擇性脫保護(hù)。對(duì)于谷氨酉夋，常用的保護(hù)基是烯丙酯（OAllyl），其脫保護(hù)過程需要催化量的Pd(0)和苯基硅烷參與。
圖1: Fmoc-Glu(OAllyl)-OH
為了展示Liberty Blue自動(dòng)化肽合成儀高效合成和官能化肽鏈的能力，我們合成了HIV-1抗體表位gp41659-671（ELLELDKWASLWN）和Afamelanotide（Ac-SYSNleEHDFRWGKPV-NH2）的分支型和內(nèi)酰胺環(huán)化變體。對(duì)于分支型變體，我們將H-Ala-OtBu與正交脫保護(hù)的Glu側(cè)鏈進(jìn)行偶聯(lián)。而對(duì)于環(huán)化變體，我們?cè)诰€性合成過程中引入了Lys(Alloc)，并在進(jìn)行內(nèi)酰胺環(huán)化之前，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行脫保護(hù)。
三、材料與方法
試劑
Fmoc-Glu(OAllyl)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-D-Phe-OH 以及 H-Ala-OtBu • HCl（使用前為游離態(tài)）均購(gòu)自 Novabiochem-MilliporeSigma（馬薩諸塞州伯靈頓）。其他氨基酸均購(gòu)自 CEM Corporation（北卡羅來納州馬修斯），并包含以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Arg(Pbf)、Glu(OtBu)、His(Boc)、Lys(Boc)、Ser(tBu) 和 Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購(gòu)自 CEM Corporation（北卡羅來納州馬修斯）。N,N-二異丙基碳二亞胺（DIC）和羥基苯并三唑（HOBt）購(gòu)自 CreoSalus（肯塔基州路易斯維爾）。哌啶購(gòu)自 Alfa Aesar（馬薩諸塞州沃德希爾）。苯基硅烷、四（三苯基膦）合鈀(0)、乙酸酐、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧雜辛烷-1,8-二硫醇（DODT）、三異丙基硅烷（TIS）和乙酸均購(gòu)自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無(wú)水乙酉迷（Et2O）均購(gòu)自 VWR（賓夕法尼亞州西切斯特）。高效液相色譜（HPLC）級(jí)水（H2O）和高效液相色譜（HPLC）級(jí)乙腈（MeCN）均購(gòu)自 Fisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。
肽鏈的合成采用0.1 mmol規(guī)模，使用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀在0.556克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.18 meq/g取代度）上進(jìn)行。脫保護(hù)反應(yīng)使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用5倍過量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。Alloc脫保護(hù)反應(yīng)使用0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.50 M苯基硅烷在DCM中進(jìn)行。通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行肽鏈環(huán)化反應(yīng)，使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液進(jìn)行。切割反應(yīng)使用CEM RazorTM高通量肽切割系統(tǒng)，采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例進(jìn)行。切割后，將肽鏈在Et2O中沉淀并過夜凍干。
注意：這些Alloc脫保護(hù)方法所需的鈀量比下一節(jié)所述方法少，但加熱時(shí)間更長(zhǎng)。
肽鏈的合成采用0.1 mmol規(guī)模，使用CEM Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀在0.556克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.18 meq/g取代度）上進(jìn)行。脫保護(hù)反應(yīng)使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用5倍過量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中進(jìn)行。5Alloc脫保護(hù)反應(yīng)使用0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.750 M苯基硅烷在DCM中進(jìn)行。通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行肽鏈環(huán)化反應(yīng)，使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液進(jìn)行。N端乙酰化反應(yīng)使用10%乙酸酐在DMF中進(jìn)行。切割反應(yīng)使用CEM Razor高通量肽切割系統(tǒng)，采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例進(jìn)行。切割后，將肽鏈在Et2O中沉淀并過夜凍干。
注意：這些Alloc脫保護(hù)方法所需的鈀當(dāng)量比前一節(jié)所述方法多，但加熱時(shí)間較短。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為Glu(OAllyl)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理，以防止因焦谷氨酉夋形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。
Glu(OAllyl)脫保護(hù)：6
用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（1 mL），并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟兩次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。
側(cè)鏈偶聯(lián)：
向反應(yīng)容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），并在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器，并加入額外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。在90℃下再微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理，以防止因焦谷氨酉夋形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。
同時(shí)Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脫保護(hù)：6
用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（2 mL），并在30°C下微波照射12分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟兩次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。
通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化：
將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟重復(fù)兩次。完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為Glu(OAllyl)脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理，以防止因焦谷氨酉夋形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。
Glu(OAllyl)脫保護(hù)：6
用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗滌（4 x 4 mL）。接著，向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM洗滌肽（4 x 4 mL）。重復(fù)此步驟一次。完成后，進(jìn)行兩個(gè)洗滌操作（4 mL），并用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為側(cè)鏈偶聯(lián)準(zhǔn)備肽。
側(cè)鏈偶聯(lián)：
向反應(yīng)容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射4分鐘。然后排空反應(yīng)容器，并加入額外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。溶液再次在90℃下微波照射4分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
N-末端乙酰化：7
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作（4 mL）。用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為肽的切割準(zhǔn)備。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與Glu(OAllyl)偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脫保護(hù)準(zhǔn)備肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必須立即進(jìn)行脫保護(hù)和功能化處理，以防止因焦谷氨酉夋形成而導(dǎo)致的非預(yù)期封端。
同時(shí)進(jìn)行Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脫保護(hù)：6
用DMF（4 x 4 mL）洗滌肽，然后用DCM（4 x 4 mL）洗滌。接著，向反應(yīng)容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反應(yīng)容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并用DCM（4 x 4 mL）洗滌肽。此步驟再重復(fù)一次。完成后，進(jìn)行兩次洗滌操作（4 mL），并用DMF（4 x 4 mL）洗滌肽，為通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化準(zhǔn)備肽。
通過內(nèi)酰胺化進(jìn)行側(cè)鏈環(huán)化：
將0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射10分鐘。然后排空反應(yīng)容器。此步驟再重復(fù)兩次。完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
肽鏈與氨基酸偶聯(lián)：
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器，為下一次偶聯(lián)反應(yīng)準(zhǔn)備肽。
N-末端乙酰化：7
將脫保護(hù)液（4 mL）加入含有肽的反應(yīng)容器中，并在90℃下微波照射1分鐘。脫保護(hù)完成后，用DMF洗滌肽（4 x 4 mL）。然后，向反應(yīng)容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分鐘。反應(yīng)完成后，排空反應(yīng)容器并進(jìn)行洗滌操作（4 mL）。用DMF洗滌肽（4 x 4 mL），為肽的切割準(zhǔn)備。
四、肽分析
使用配備PDA檢測(cè)器的Waters Acqity UPLC系統(tǒng)對(duì)肽進(jìn)行分析，該系統(tǒng)配有一根Acquity UPLC BEH C8色譜柱（1.7微米，2.1 x 100毫米）。UPLC系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。峰分析在Waters MassLynx軟件上完成。分離通過梯度洗脫進(jìn)行，流動(dòng)相為0.1% TFA在(i) H2O和(ii) MeCN中。
五、結(jié)果
在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的Glu分支型HIV-1抗體表位gp41659–671的目標(biāo)肽純度為82%（圖2）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型HIV-1抗體表位gp41659–671的目標(biāo)肽純度為87%（圖3）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的Glu分支型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為85%（圖4）。在Liberty Blue自動(dòng)化微波肽合成儀上，通過微波增強(qiáng)的固相肽合成（SPPS）制備的內(nèi)酰胺環(huán)化型阿法美拉肽的目標(biāo)肽純度為80%（圖5）。
圖2：Glu分支型HIV-1抗體表位gp41659–671的UPLC色譜圖
圖3：內(nèi)酰胺環(huán)化型HIV-1抗體表位gp41659–671的UPLC色譜圖
圖4：Glu分支型阿法美拉肽的UPLC色譜圖
圖5：內(nèi)酰胺環(huán)化型阿法美拉肽的UPLC色譜圖
五、結(jié)果
Liberty Blue自動(dòng)化肽合成儀能夠簡(jiǎn)便高效地合成各種功能化的肽。通過執(zhí)行自動(dòng)化正交脫保護(hù)（及其相關(guān)的合成操作），我們合成了HIV-1抗體表位gp41659–671和阿法美拉肽的分支型和內(nèi)酰胺環(huán)化型變體。這四種肽的純度在80%到87%之間，每個(gè)合成過程需要3到3.5小時(shí)，每次合成只產(chǎn)生700到750 mL的總廢物。
六、引用
(1) Krall, N.; da Cruz, F. P.; Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Nat. Chem.2016, 8, 103–113.
(2) Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Chem. Rev. 2015, 115, 2174–2195.
(3) Nielsen, D. S.; Shepherd, N. E.; Xu, W.; Lucke, A. J.; Stoermer, M. J.Fairlie, D. P. Chem. Rev. 2017, 117, 8094–8128.
(4) Wynn, J. E.; Zhang, W.; Falkinham, III, J. O.; Santos, W. L. ACS Med.Chem. Lett. 2017, 8, 820–823
(5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature."
(6) Automated Alloc-deprotection adapted from: Wilson, K. R.; Sedberry,S.; Pescatore, R.; Vinton, D.; Love, B.; Ballard, S.; Wham, B. C.;Hutchison, S. K.; Williamson, E. J. J. Pep. Sci. 2016, 22, 622–627.
(7) CEM Application Note (AP0114) - “Automated N-Terminal Acetylation."
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