乳酸菌在白酒發(fā)酵過(guò)程中的功能與作用研究

IL-11elisa試劑盒
1、 樣品的采集樣品為山東芝麻香型白酒酒醅。芝麻香型白酒釀造分為堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵兩個(gè)發(fā)酵階段，跟蹤采集了芝麻香型白酒釀造過(guò)程中堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過(guò)程中的酒醅。選擇 I、II 兩個(gè)班組堆積酒醅作為平行樣品進(jìn)行跟蹤取樣，不同取樣位置取 50 g 左右酒醅混合成一個(gè)樣品。堆積發(fā)酵周期為 18 h，每隔 6 h 取一次樣品，取樣時(shí)間分別為 0、6、12、 18 h。窖池發(fā)酵周期為 50 d，取樣時(shí)間分別為 3、5、 10、15、20、25、30、35、40、50 d。將采集的酒醅樣品密封，−80 °C 保存。
2、 主要試劑和儀器磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、、10% SDS、乙酸鈉、、乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(北京)有限公司；溶液、2SG Fast qPCR Master Mix (High Rox)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。冷凍離心機(jī)，Beckman Coulter 公司；MiniBeadbeater 細(xì)胞破碎儀，Biospec 公司；Genius 3 旋渦振蕩器，IKA 公司；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；NanoDrop 8000 蛋白核酸測(cè)定分光光度計(jì)、熒光定量 qPCR，Thermo Fisher Scientific 公司。
3、 DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序準(zhǔn)確稱取 7 g 酒醅，加入 20 mL 無(wú)菌的 PBS 緩沖液(0.042 3 mol/L 磷酸二氫鈉，0.057 7 mol/L 磷酸氫二鈉)懸浮，漩渦振蕩，300×g 離心 5 min，收集上清液。將上清液 10 000×g 離心 15 min 收集細(xì)胞沉淀。DNA 的提取參考 Wang 等的方法。采用適用于大多數(shù)細(xì)菌的 16S rRNA 基因 V3−V4 區(qū)通用引物 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。 PCR 擴(kuò)增體系(20 μL)：5×FastPfu 緩沖液 4 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 上、下游引物各 0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶 0.4 μL，樣品基因組模板 DNA 10 ng，超純水補(bǔ)足至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件： 95 °C 3 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 45 s，共 27 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，對(duì) DNA 條帶進(jìn)行切膠純化回收。純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行定量，根據(jù)定量結(jié)果混合不同樣品的 PCR 產(chǎn)物。構(gòu)建 MiSeq 文庫(kù)，使用 Illumina MiSeq PE300 測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。通過(guò) QIIME (v1.8.0)和 Mothur 對(duì)測(cè)序結(jié)果分析處理，去掉質(zhì)量不好的序列、長(zhǎng)度小于 150 bp 的序列及含嵌合體的序列，并將相似度大于 97%的序列聚類為一個(gè)操作分類單元 OTU (Operational taxonomic unit)。計(jì)算 Shannon 指數(shù)(反映樣品的多樣性程度) 和 Chao1 指數(shù)(反映樣品中群落豐富度)，評(píng)估樣品微生物多樣性。利用在線比對(duì)引擎 BLAST 將 OTU 的代表序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得 OTU 的物種信息。