雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灢襟E

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒―ual-Luciferase Reporter Assay）是一種常用的分子生物學技術，用于研究基因表達調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導通路以及藥物篩選。該實驗利用了兩個不同的熒光素酶報告基因：螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase，通常作為實驗報告基因）和海腎熒光素酶（Renilla Luciferase，通常作為內(nèi)參報告基因）。這兩種熒光素酶具有不同的發(fā)光底物和發(fā)光光譜，可以在同一實驗中獨立測量其活性。

實驗步驟：

構(gòu)建報告基因載體：

將感興趣的啟動子或調(diào)控元件克隆到螢火蟲熒光素酶基因（luc）上游，構(gòu)建成實驗報告基因載體。

將海腎熒光素酶基因（hRluc）構(gòu)建到另一個載體中，通常與一個恒定表達的啟動子（如SV40）連接，用作內(nèi)參報告基因。

細胞轉(zhuǎn)染：

將上述兩個載體共同轉(zhuǎn)染入細胞中。實驗報告基因的表達水平將受到研究的啟動子或調(diào)控元件的影響，而內(nèi)參報告基因的表達水平相對恒定，用于校正轉(zhuǎn)染效率和細胞活性。

細胞培養(yǎng)：

在特定條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細胞，使其表達熒光素酶基因。

裂解細胞：

收集并裂解細胞，釋放熒光素酶。

測定熒光素酶活性：

首先，加入螢火蟲熒光素酶的底物（如熒光素），測定發(fā)光強度。螢火蟲熒光素酶催化底物發(fā)生化學反應，發(fā)出綠色熒光，強度與螢火蟲熒光素酶的活性成正比。

然后，加入海腎熒光素酶的底物（如共elenterazine），測定發(fā)光強度。海腎熒光素酶催化底物發(fā)出藍色熒光，強度與海腎熒光素酶的活性成正比。

通過加入特定底物分別測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的發(fā)光強度。

數(shù)據(jù)分析：

計算螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值（通常是螢火蟲熒光素酶活性除以海腎熒光素酶活性）。這種比值可以校正轉(zhuǎn)染效率和細胞數(shù)目差異，得到更為準確的實驗結(jié)果。