PCR反應引物設計關鍵點確定

PCR反應引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。引物設計應注意如下要點：

1、引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

2、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個以上的連續堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發機率增加。

3、引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4、引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5、引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。

6、 ?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端?G 值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G 值相對較高的引物。引物的3’端的?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。

7、引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

8、對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。