細胞凍存及復蘇操作步驟

細胞凍存及復蘇操作步驟：

一、凍存

1、消化細胞，將細胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3、沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。

6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時應小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

二、復蘇

1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。

3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，**天觀察生長情況。