小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞原代培養(yǎng)

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞原代培養(yǎng)：

1、取約500mg脂肪組織（自外科手術(shù)患者的皮下獲?。?，再將脂肪組織一次擠壓進(jìn)入準(zhǔn)備好的15m離心管中，每個(gè)離心管中的組織不超過5ml。

2、吸取緩沖液PBS7ml加入到上述裝有組織的離心管中，用吸管吹打10~20次，然后靜置1min左右，用吸管將組織下層的液體吸出。如此反復(fù)直到所吸出的液體呈透明狀，不帶有血細(xì)胞為止。

3、向有的試管中加入與組織量相同大約5ml左右的消化液（yi酶0.25%，I型膠原酶0.1%以1：1比例混合配制而成），將試管密封，放入37°C恒溫?fù)u床中，190r/min，震蕩消化30min。此時(shí)液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細(xì)胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個(gè)核細(xì)胞的液體；

4、吸出離心管中的下層液體移入含*培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新離心管中終止消化，然后將離心管封閉，1500rpm離心10min。

5、用吸管吸取上清后去掉，加入1ml培養(yǎng)基，輕輕吹打10~20次制成細(xì)胞懸液，將各個(gè)離心管中的胞懸液收集起來，接種待用。

6、在剩余脂肪中加入新的yi酶和膠原酶，重復(fù)以上步驟繼續(xù)消化，重復(fù)2-3次，將收集到的有核細(xì)胞按照一定的密度接種到培養(yǎng)瓶中，放入37°C、5%?CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

7、次換液：大約12-24小時(shí)后，觀察細(xì)胞貼壁即可進(jìn)行次換液，此后每隔3天換液，待細(xì)胞生長至融合后進(jìn)行傳代。