免疫熒光試劑盒操作步驟

免疫熒光染色試劑盒(Immunol Fluorence Staining Kit)系列是Elabscience®開發的用于細胞或組織切片檢測免疫熒光染色的試劑盒。在有適當的一抗檢測特定的目標蛋白時，就可以使用免疫熒光染色試劑盒檢測到紅色、綠色或藍色等熒光。

推薦Elabscience®的免疫熒光染色的試劑盒。

操作步驟：

1. 免疫熒光染色的準備工作

A.固定液的準備：

推薦使用4%多聚甲醛作為固定液(E-IR-R113)，或根據特定的一抗或樣品采用有效成分為乙醇、甲醇或其它類型的固定液。

B.TBST工作液的準備：

推薦使用TBST作為洗滌液，可使用Elabscience®的10×TBST(E-BC-R335)，按照1:9的比例用去離子水稀釋至1×的TBST工作液。

C.一抗稀釋液的準備：

推薦使用Elabscience®的抗體稀釋液(E-IR-R106)，也可選用PBS作為一抗稀釋液。

D.一抗的稀釋：

按照一抗說明書中推薦的用于免疫熒光染色的稀釋比例用一抗稀釋液稀釋一抗。

E.熒光標記二抗的稀釋：

推薦使用Elabscience®的抗體稀釋液(E-IR-R106)，按照1:50的比例用將試劑盒中的免疫熒光染色二抗稀釋成工作液，也可選用PBS作為抗體稀釋液。根據熒光的強弱，稀釋的比例可以適當提高或降低。

2. 對于貼壁細胞

A.  取普通潔凈蓋玻片于70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內吹干或用細胞培養級PBS或0.9%NaCl等溶液洗滌三遍，再用細胞培養液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內，種入細胞培養過夜，使約為50%-80%滿。

B.  按照特定的實驗目的處理細胞后，吸盡培養液，加入1 ml固定液，固定10分鐘或更長時間(可4°C固定過夜)。

C.  去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數次。

D.  用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘，可以在搖床上輕輕搖動。

E.  去除封閉液，用稀釋的特定一抗濕盒內37°C避光孵育60分鐘，可以在搖床上輕輕搖動。為增強與一抗的結合，可以4°C孵育過夜。

F.  去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。每次洗滌時都可以在搖床上輕輕搖動。

G.  去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標記的二抗濕盒內37°C避光孵育60分鐘。

H.  TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當注意避光操作。

I.   復染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對標本進行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

J.   滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液，切勿弄反。

K.   如果一抗選用適當，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。

3. 對于懸浮細胞

A.   離心收集細胞樣品于1.5 ml離心管內，吸除上清后輕輕彈散細胞。

B.   加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細胞，固定10分鐘或更長時間(可4°C過夜)。

C.   離心去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘。洗滌期間可以用手或搖床輕輕晃動。

D.   最后一次離心后吸去大部分液體保留約50 μL液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細胞分布均勻。

E.   稍晾干，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。如果條件許可，可以使用適當的離心機，通過離心把細胞貼緊在載玻片上。

F.   用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘。

G.   去封閉液，用稀釋的特定一抗濕盒內37°C避光孵育60分鐘。為增強與一抗的結合，可以4°C孵育過夜。

H.   去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。

I.    去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標記的二抗濕盒內37°C避光孵育60分鐘。

J.    TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當注意避光操作。

K.   復染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對標本進行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

L.    滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡。

M.   如果一抗選用適當，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。

4. 對于組織切片

A.   對于石蠟切片，需先完成脫蠟、水化和抗原修復。對于冰凍切片可以直接按照下面的步驟操作。

B.   用固定液固定10分鐘或更長時間(可4°C過夜)。

C.   去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動數次。

D.   用試劑盒中的正常山羊血清封閉液(E-IR-R110)封閉30分鐘，可以在搖床上輕輕搖動。

E.   去除封閉液，用稀釋的特定一抗濕盒內37°C孵育60分鐘，可以在搖床上輕輕搖動。為增強與一抗的結合，可以4°C作用過夜。

F.   去除一抗，用TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘。每次洗滌時都可以在搖床上輕輕搖動。

G.   去除TBST工作液，加入100 μL稀釋好的熒光標記的二抗濕盒內37°C避光孵育60分鐘。

H.   TBST工作液洗滌3~5次，每次3~5分鐘，期間適當注意避光操作。每次洗滌時都可以在搖床上輕輕搖動。

I.    復染核：滴加試劑盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，對標本進行染核，TBST工作液洗滌玻片5分鐘，洗滌4次去除多余的DAPI染色液。

J. 滴一滴試劑盒提供的抗熒光淬滅封片液(E-IR-R119)于載玻片上，蓋上蓋玻片，盡量避免氣泡。

K.   如果一抗選用適當，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光。