PCR引物設計需要遵循原則

PCR引物設計需要遵循原則：
1、引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。
2、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。
3、引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
4、引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5、引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。
6、ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。
7、引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。
8、對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物的載體的相應序列而確定。
但是在實際設計過程中，往往很難同時滿足以上條件，因此只需要在設計引物時盡可能滿足即可，沒必要太過糾結。
同時需要注意，各種模板的引物設計難度不一，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。