實時熒光定量PCR檢測方法

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要采用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基于探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。

1. DNA結合染料法

原理：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用于核算定量和基因表達驗證。

優缺點：它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，并且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會與單鏈DNA結合，并且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

2. 基于探針的化學法

原理：應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用于核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點：探針法的鑒別能力遠遠大于DNA結合染料法，因為它們只與目的產物結合，從不與引物二聚體或其他非特異產物結合，缺點是它的合成價格高。

探針法中的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅基團則在3’末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光信號。

圖3 TaqMan探針熒光信號產生機制

3. 淬滅染料引物法

原理：采用熒光標記引物擴增，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應用于核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點：探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價格高。