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  • 上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
    初級(jí)會(huì)員 | 第8年

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    elisa檢測(cè)試劑盒
    ATCC細(xì)胞
    菌種
    生化試劑
    生物抗體
    生物培養(yǎng)基
    酶聯(lián)免疫試劑盒
    PCR試劑盒
    elisa進(jìn)口試劑盒
    核酸檢測(cè)試劑盒
    檢測(cè)試劑盒
    生化檢測(cè)試劑盒
    科研細(xì)胞
    標(biāo)準(zhǔn)品
    PCR檢測(cè)試劑盒
    溶液
    pcr相關(guān)試劑

    定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品制備

    時(shí)間:2023/7/10閱讀:284
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      原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白,以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法,其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

    1.培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。

    2.棄培養(yǎng)基,用1X PBS漂洗細(xì)胞2次,去盡殘留培養(yǎng)基。

    3.加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 μl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶),刮落細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到Ep管。注意:冰上操作。

    4.超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。

    5.煮沸樣品5 minutes。

    6.離心 12000g, 5 min,取上清。

    7.電泳分離:上樣15μl~20 μl 至 SDS-PAGE 膠 ( 10 cm x 10 cm)電泳。
    如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平,應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解細(xì)胞,收集裂解液至離心管中,在振蕩器上混勻4~15min, 14000g離心15min( 4℃),棄沉淀,用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量,進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照,通常用beta-actin。


    注意:一般上樣20~30 μg已足夠,如待檢蛋白為低豐度蛋白,可加大上樣量至100μg,但電泳條帶易拖尾,可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。


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