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    PCR反應引物的延伸

    時間:2022/8/15閱讀:2929
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    PCR反應引物的延伸:

          DNA模板-引物復合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條與模板DNA鏈互補的新鏈。引物延伸溫度的選擇取決于DNA聚合酶的最適溫度, 一般為70~75℃。延伸所需要的時間取決于模板DNA的長度。一般在72℃條件下,Taq DNA聚合酶催化的合成速度大約為40~60個堿基/秒,其速度取決于緩沖溶液的組成、ph值、鹽濃度與DNA模板的性質。

          PCR的三個反應步驟反復進行,使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA擴增量可用Y=(1+X)n計算。

          Y代表DNA片段擴增后的拷貝數,X表示平(Y)均每次的擴增效率,n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%。反應初期,目的DNA片段的增加呈指數形式,隨著PCR產物的逐漸積累,被擴增的DNA片段不再呈指數增加,而進入線性增長期或靜止期,即出現“停滯效應",這種效應稱平臺效應。

    PCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。引物如果跟原始DNA模板結合,從3'端開始擴增延伸,其產物的5'端是固定的,3'端則沒有固定的止點,長短不一,這就是“長產物片段"。引物如果是以新合成的DNA鏈(即“長產物片段")為模板擴增時,模板的5'端序列是固定位置的,即新合成延伸鏈的3'端是固定的,使新合成DNA鏈的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段"。由于新合成的DNA鏈在下一個循環反應中可以作為引物結合擴增的模板,“短產物片段"是按指數倍數增加。而原始DNA模版的量是固定的,“長產物片段"只按算術倍數增加,在最終PCR中的含量幾乎可以忽略不計。

        一般PCR反應包括上述變性-退火-延伸三個溫度點。但在擴增某些較短目標序列(長度為100~300bp時)時,可采用二溫度點法,即把退火與延伸溫度合二為一。



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