標記熒光抗體常用Marsshall法方法及步驟

標記熒光抗體常用Marsshall法方法及步驟：

一、材料

抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。

二 、方法及步驟

抗體的準備

取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～10min。

熒光素的準備

根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。
1．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。
2．總蛋白量(AXB)＝Crag。
3．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
4．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
5．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。
6． PBS量D-(B+F)=Gml。

注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。

③結合(或標記) 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內加完)，加完后，繼續避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。

④透析 結合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜。

⑤過柱 取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。