PCR實驗標準操作規范

PCR實驗，全稱聚合酶鏈式反應實驗，是一種在體外快速擴增特定DNA片段的分子生物學技術。該技術通過模擬DNA天然復制過程，利用引物、DNA聚合酶和脫氧核苷酸（dNTP）實現目標序列的指數級擴增。其核心原理基于DNA雙鏈的變性、引物的退火結合以及DNA聚合酶的延伸合成三個步驟的循環重復。

1、前期準備：

l 模板DNA提取與純化：從細胞、血液或組織中提取DNA/RNA，去除蛋白質、多糖等雜質。DNA建議用TE緩沖液保存于-20℃，RNA需置于-80℃。

l 引物設計：根據目標序列設計特異性引物，確保退火溫度匹配。

2、反應體系配置：

l 包含模板DNA、引物、Mg2?、DNA聚合酶及緩沖液。

l 熱啟動PCR需額外添加修飾物（如抗體）抑制酶活性。

3、循環程序：

l 初始變性（94-98℃，5分鐘）→ 循環變性（93-98℃，30秒）→ 退火（50-65℃，30秒）→ 延伸（72℃，1分鐘）→ 重復25-35次 → 最終延伸（72℃，5分鐘）。

4、產物分析：

l 普通PCR：瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小。

l qPCR：通過熒光信號積累曲線定量分析。

l 膠回收：若存在非特異擴增，需跑膠后回收目的片段純化。

PCR成功率取決于細節控制。PCR技術作為分子生物學基石，持續推動生命科學邊界拓展。其核心價值在于將不可見的DNA片段轉化為可量化、可分析的宏觀產物，為人類理解生命本質和應對健康挑戰提供關鍵工具。