用于顯微鏡的折射式自適應(yīng)光學(xué)元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy

自適應(yīng)光學(xué)的英文名為Adaptive optics，簡(jiǎn)稱 AO。 AO是指一系列強(qiáng)大的圖像校正技術(shù)，已證實(shí)對(duì)多種生命科學(xué)顯微鏡的方法具有優(yōu)勢(shì)。然而，傳統(tǒng)AO系統(tǒng)的額外復(fù)雜性和成本，使得自適應(yīng)光學(xué) (AO)無(wú)法在顯微鏡中的廣泛應(yīng)用。 德國(guó)Phaseform廠家開(kāi)發(fā)了折射式、在線的AO系統(tǒng)，可以減少許多復(fù)雜的設(shè)置和降低成本。

在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們探討了我們的折射式AO概念如何增強(qiáng)顯微鏡能力，并通過(guò)寬視場(chǎng)AO熒光顯微鏡來(lái)展示這一點(diǎn)。

圖1:油/水浸泡顯微鏡設(shè)置。

自適應(yīng)光學(xué)AO在顯微鏡中的應(yīng)用

人們常說(shuō)，從顯微鏡到照相機(jī)和望遠(yuǎn)鏡，光學(xué)成像系統(tǒng)的好壞取決于它們的光學(xué)性能。這可能是真的，但圖像的好同時(shí)也取決于中間介質(zhì)好，只有在中間介質(zhì)允許的情況下，成像質(zhì)量才會(huì)好。

在許多情況下，現(xiàn)代顯微鏡的性能，產(chǎn)生像差的來(lái)源有2個(gè)方面：其一是：被測(cè)樣品和物鏡之間的折射式率不匹配，導(dǎo)致球面像差。其二是：被測(cè)樣品的形狀以及折射式率的變化，導(dǎo)致依賴于樣本本身的復(fù)雜像差。這種來(lái)著像差的“挑戰(zhàn)”在單分子和深層組織的成像中更為嚴(yán)峻。如果不加以修正，它們會(huì)降低所獲取圖像的對(duì)比度和清晰度 [1-2]，阻止顯微鏡達(dá)到其理論分辨率。

在過(guò)去的二十年里，在顯微鏡中使用自適應(yīng)光學(xué)的廣泛研究已經(jīng)證明了它的有效性。AO可以補(bǔ)償像差并恢復(fù)顯微鏡的原始性能，而不受被測(cè)樣品和樣品架類型的影響，從而有助于放寬指數(shù)匹配標(biāo)準(zhǔn)并縮短被測(cè)樣品制備時(shí)間。AO幾乎適用于所有高級(jí)顯微鏡技術(shù)：共聚焦（confocal,）、寬視場(chǎng)（wide-field）、多光子（multi-photon）甚至超分辨率（super-resolution）方法，比如如 STED、SMS、STORM。特別是對(duì)于深層組織成像顯微鏡（一種地允許在自然環(huán)境中檢查細(xì)胞的顯微鏡），AO可以在遠(yuǎn)低于被測(cè)樣品表面的地方保持分辨率。

自適應(yīng)光學(xué)AO的商業(yè)化之路

在專業(yè)的天文學(xué)應(yīng)用中，自適應(yīng)光學(xué)AO子系統(tǒng)無(wú)處不在，但是AO自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)在顯微鏡應(yīng)用中的發(fā)展很緩慢。這其中的主要原因是，相比于專業(yè)天文學(xué)，顯微鏡的成本較低，此外顯微鏡通常在尺寸上小得多，并且由折射式工作原理的透鏡組成。

盡管如此，在的顯微鏡領(lǐng)域一塊，已經(jīng)產(chǎn)生了個(gè)把商業(yè)自適應(yīng)AO系統(tǒng)用于顯微鏡的解決方案。 它們作為顯微鏡擴(kuò)展端口的附件。在內(nèi)部結(jié)構(gòu)中，他們通過(guò)將光瞳平面?zhèn)鬟f到可變形鏡 (DM) 來(lái)執(zhí)行波前測(cè)量和校正，并在校正后將光重新引導(dǎo)回顯微鏡的檢測(cè)/成像路徑。

但是，這些代產(chǎn)品需要仔細(xì)設(shè)置，不能普遍兼容，而且依然相對(duì)笨重。

圖2:傳統(tǒng)的自適應(yīng)光學(xué)顯微鏡使用可變形的鏡子來(lái)施加光路的折疊

圖3:Phaseform為直接集成開(kāi)發(fā)了在線自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)

Phaseform 全折射式AO顯微鏡

Phaseform 的愿景是讓大多數(shù)顯微鏡用戶都能使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)。 為了提供具有不妥協(xié)性能的集成、更緊湊的AO解決方案，我們認(rèn)為，從反射波前調(diào)制到折射式波前調(diào)制的技術(shù)轉(zhuǎn)變是必要的。因此，我們提出了一種專為顯微鏡設(shè)計(jì)的新型在線AO系統(tǒng)（圖 3）。

Phaseform的AO顯微鏡是通過(guò)以下2點(diǎn)，優(yōu)化了傳統(tǒng)AO系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

(A) 可變形反射鏡替換成折射式DPP變形鏡

(B) 省略波前傳感器，改用像差估計(jì)算法。

折射式 DPP變形鏡——自適應(yīng)AO顯微鏡的關(guān)鍵技術(shù)

Phaseform相位調(diào)制變形鏡DPP(Deformable Phase Plate)，如圖 4 所示，是一種新型的動(dòng)態(tài)光學(xué)元件。它的名字來(lái)自傳統(tǒng)的變形鏡，一種帶有表面浮雕的透明材料薄板，用于補(bǔ)償高級(jí)顯微鏡應(yīng)用中的固定像差。然而，與那些不同的是，DPP 的表面可以通過(guò)跨越通光孔徑的63個(gè)致動(dòng)器陣列動(dòng)態(tài)地塑造成任何任意形式[3]。 因此，它是可變形反射鏡的折射式替代品。

圖 4：折射式 63個(gè)致動(dòng)器-相位調(diào)制變形鏡DPP，能夠校正徑向7階Zernike模式。

DPP相位調(diào)制變形鏡 用于顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)是：

• 透射式：可以插入任何光路中，無(wú)需重新計(jì)算、重新成像或折疊光路。
• 尺寸緊湊：作為超薄透射元件，DPP變形鏡 從系統(tǒng)的角度來(lái)看已經(jīng)提供了空間節(jié)省，但其占用空間小，特別適合集成，甚至可以連續(xù)堆疊多次。
• 高效：它的操作與偏振無(wú)關(guān)，并且顯示出有限的衍射損耗。
• 多功能：自動(dòng)校正一階和二階球差和散光對(duì)于顯微鏡應(yīng)用特別有用。 然而，更復(fù)雜的像差，例如在深部組織成像中由不同折射式率的區(qū)域?qū)е碌南癫睿枰唠A的校正，DPP 可以提供，類似于DM。
• 動(dòng)態(tài)：可以在高分辨率成像和顯微鏡設(shè)置中實(shí)時(shí)控制和操作DPP

無(wú)波前傳感器的估算法SWE（Sensorless Wavefront Estimation）

光學(xué)像差的預(yù)知對(duì)其校正至關(guān)重要。 波前傳感器，例如Shack-Hartmann傳感器或干涉儀，通常用于經(jīng)典AO系統(tǒng)中來(lái)測(cè)量動(dòng)態(tài)像差。 然而，使用波前傳感器一方面增加了AO系統(tǒng)的復(fù)雜性和成本，同時(shí)也不是一個(gè)實(shí)用的解決方案。尤其是對(duì)于顯微鏡應(yīng)用，可能僅僅是因?yàn)轱@微鏡設(shè)置的限制，甚至是由于所研究標(biāo)本的性質(zhì)而受限制。而SWE無(wú)波前傳感器估算法（Sensorless wavefront estimation）是一個(gè)替代方案，可替代傳統(tǒng)AO顯微鏡中的波前傳感器，在這種情況下，像差動(dòng)態(tài)是緩慢和相對(duì)小的。

SWE算法的兩個(gè)一般要求是：

1. 了解樣本或成像目標(biāo)，從而創(chuàng)建有效的品質(zhì)因數(shù)，例如圖像清晰度或?qū)Ρ榷取＿@是基于針對(duì)波前調(diào)制器的不同布置對(duì)一系列捕獲圖像進(jìn)行定量?jī)?yōu)化的實(shí)際像差估計(jì)，所必需的。
2. 為所采用的波前調(diào)制器提供一個(gè)可預(yù)測(cè)的和穩(wěn)健的控制方案。波前調(diào)制器需要放在幾個(gè)精確的相對(duì)配置中，才能有效地實(shí)施任何 一種SWE 方法。PhaseformDPP的靜電驅(qū)動(dòng)原理和直觀的控制算法特別適合此類任務(wù)[4-5]。

盡管SWE估算法的代價(jià)是增加了計(jì)算負(fù)載，犧牲了圖像采集時(shí)間。但通過(guò)SWE大大降低了AO系統(tǒng)的硬件復(fù)雜性（如下面的案列展示）。此類方法的不同變體的優(yōu)勢(shì)已在許多顯微鏡模式中得到證明，例如共聚焦、雙光子熒光、結(jié)構(gòu)化照明、光片、STED 和 SMS [1-2]。

案例展示：即插即用自適應(yīng)光學(xué)顯微鏡

DPP的傳輸工作原理與SWE相結(jié)合，使即插即用的AO系統(tǒng)成為可能。與安裝在傳統(tǒng)籠中的透鏡類似，DPP可以插入顯微鏡的光路中，最小到零中斷，以提供系統(tǒng)和樣品引起的像差的動(dòng)態(tài)校正。圖5描述了Phaseform的Delta 7形式的DPP集成到商業(yè)(圖5a和5b)和定制顯微鏡(圖5c和5d)的4個(gè)示例。例子包括熒光寬視場(chǎng)和雙光子顯微鏡成像深入到生物樣品。SWE和DPP的傳輸特性使其易于集成為折光直列系統(tǒng)。

圖5:商用和定制顯微鏡中基于dpp的AO系統(tǒng)的示例。(a)商用顯微鏡物鏡和轉(zhuǎn)塔之間集成的DPP。(b) DPP集成在商用顯微鏡的共軛瞳孔平面上，使用連接到相機(jī)端口的中繼光學(xué)器件。(c)用于熒光寬視場(chǎng)成像的“小的AO顯微鏡”[5]。(d)將DPP集成到定制的雙光子顯微鏡的照明路徑中(與Prof。Alexander Jesacher，因斯布魯克醫(yī)科大學(xué))[10]。

AO在顯微鏡中的優(yōu)勢(shì)如圖6所示。描述了深入樣品的雙光子成像的實(shí)例結(jié)果，以及系統(tǒng)和樣品誘導(dǎo)像差的波前無(wú)傳感器補(bǔ)償。左邊的(a)列顯示了在沒(méi)有和有AO校正的情況下，對(duì)超過(guò)150 μm深的小鼠腦切片進(jìn)行神經(jīng)元成像的結(jié)果(與因斯布魯克醫(yī)科大學(xué)Alexander Jesacher教授小組合作)。柱(b)為球體樣品40 μm深度成像結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)是在與Prospective Instruments (Stefanie Kiderlen博士和Lukas Krainer博士)合作的雙光子顯微鏡(MPX-1040)中安裝DPP完成的。

圖6:通過(guò)(a)定制和(b)商業(yè)獲取的各種樣品的圖像(MPX-1040, Prospective Instruments)使用DPP進(jìn)行無(wú)波前傳感器AO校正的雙光子顯微鏡。

結(jié)論

Phaseform認(rèn)為，折射波前調(diào)制器和像差估計(jì)算法的進(jìn)步將改變自適應(yīng)光學(xué)顯微鏡。我們?cè)O(shè)想一個(gè)未來(lái)，就像在天文學(xué)中發(fā)生的那樣，自適應(yīng)光學(xué)將成為每一臺(tái)自建和每一臺(tái)商用顯微鏡的默認(rèn)配置。這個(gè)未來(lái)可能比我們想象的更近。

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