離子交換色譜原理

       離子交換色譜法

　　純化蛋白質(zhì)和其他帶電分子的方法是離子交換色譜法。在陽離子交換色譜中，帶正電荷的分子被帶負(fù)電荷的固體支持物所吸引。相反，在陰離子交換色譜中，帶負(fù)電的分子被帶正電的固體支持物吸引。


　　機(jī)制

　　為了優(yōu)化所有帶電分子的組合，流動相通常是具有低至中等電導(dǎo)率(即低至中等鹽濃度)的溶液。分子在固體載體上的吸附是由樣品分子中帶相反電荷的離子基團(tuán)和載體上的功能配體之間的離子相互作用驅(qū)動的。相互作用的強(qiáng)度取決于分子和官能團(tuán)上電荷的數(shù)量和位置。通過增加鹽濃度(通常通過使用線性鹽梯度)，具有最弱離子相互作用的分子首先開始從色譜柱中洗脫。具有更強(qiáng)離子相互作用的分子需要更高的鹽濃度，并在梯度中更晚洗脫。離子交換樹脂的結(jié)合能力通常很高。


　　緩沖液pH值

　　通常，流動相緩沖液的pH值必須在帶電分子的pI(等電點(diǎn))或pKa(酸離解常數(shù))和固體載體上帶電基團(tuán)的pKa之間。例如，在陽離子交換色譜中，使用pKa為1.2的固體載體上的官能團(tuán)，pI為8.2的樣品分子可以在pH為6.0的流動相緩沖液中運(yùn)行。在陰離子交換層析中，當(dāng)固相支持物的pKa為10.3時(shí)，pI為6.8的分子可以在pH為8.0的流動相緩沖液中運(yùn)行。


　　鹽梯度

　　與大多數(shù)其他色譜模式(SEC除外)一樣，蛋白質(zhì)樣品在強(qiáng)保留條件下被注入色譜柱。然后應(yīng)用線性增加的鹽濃度梯度從柱中洗脫樣品成分。另一種使用線性漸變的方法是使用梯形漸變。這需要不太復(fù)雜的設(shè)備。如果適當(dāng)?shù)柠}濃度是已知的(通常來自線性梯度實(shí)驗(yàn))，不同的級分可以被非常有效地洗脫。


　　不同的pH值

　　許多色譜工作者也利用pH值的變化來影響分離。在陽離子交換色譜中，提高流動相緩沖液的pH值會降低分子的質(zhì)子化程度，因此正電荷的程度也會降低。結(jié)果，蛋白質(zhì)不再能與帶負(fù)電荷的固體支持物形成離子相互作用，最終導(dǎo)致分子從柱上洗脫。在陰離子交換色譜中，降低流動相緩沖液的pH值會使分子變得更加質(zhì)子化，從而攜帶更多的正電荷(和更少的負(fù)電荷)。結(jié)果，蛋白質(zhì)不再能與帶正電荷的固體支持物形成離子相互作用，這導(dǎo)致分子從柱中洗脫。