離子色譜的優(yōu)勢(shì)和局限性

　　離子色譜儀是根據(jù)離子與固定相和流動(dòng)相的相互作用來(lái)分離離子的儀器。這些相在吸引陰離子的陰離子柱和吸引陽(yáng)離子的陽(yáng)離子柱之間是不同的。每個(gè)色譜柱只能測(cè)量它所吸引的特定類型離子的電導(dǎo)率。離子會(huì)根據(jù)對(duì)特定樹(shù)脂的親和力，以不同的速度通過(guò)離子色譜儀的色譜柱，根據(jù)離子電荷和大小的不同，相互分離。洗脫液通過(guò)色譜柱時(shí)，對(duì)樹(shù)脂親和力較弱的離子會(huì)較快通過(guò)色譜柱，首先被洗脫，而對(duì)色譜柱親和力較強(qiáng)的離子會(huì)較慢通過(guò)色譜柱。


　　離開(kāi)色譜柱后，離子被電導(dǎo)檢測(cè)器測(cè)量。檢測(cè)器將生成色譜圖，并繪制電導(dǎo)率和時(shí)間之間的關(guān)系。每個(gè)離子在圖上產(chǎn)生一個(gè)峰，其高度取決于注入溶液中的相對(duì)離子濃度。這些測(cè)量可用于確定未知樣品中分析物的濃度。為了消除流動(dòng)相中離子可能造成的干擾，可以在電導(dǎo)率測(cè)量前使用抑制器去除不必要的電解質(zhì)。當(dāng)溶液通過(guò)抑制器時(shí)，洗脫液中的離子被非離子物質(zhì)取代。


　　影響分離的參數(shù)包括：

　　色譜柱——因?yàn)楦叻肿訕?shù)脂的孔隙率和大小會(huì)影響分離度，所以要選擇合適的色譜柱才能達(dá)到良好的分離。較小的粒徑可以提高分辨率，但會(huì)增加系統(tǒng)的背壓。例如，填充有大尺寸珠子的柱用于蛋白質(zhì)純化的早期階段，而較小的珠子用于流速較慢的最終純化。


　　緩沖液——用作陽(yáng)離子交換色譜流動(dòng)相的典型緩沖液包括甲酸鹽(3.8)、乙酸鹽(4.6)、MES  (6.1)、磷酸鹽(7.2)或tris  (8.1)，而用作陰離子交換色譜流動(dòng)相的緩沖液包括tris、(9.7)和二乙胺(11)。為IEX選擇緩沖液時(shí)，請(qǐng)記住pka值(在括號(hào)中提供)。為了保持所需的pH值，緩沖溶液的濃度通常應(yīng)在2050mm的范圍內(nèi)


　　緩沖液pH-對(duì)于陽(yáng)離子交換色譜，洗脫緩沖液的pH保持在4-7的范圍內(nèi)，對(duì)于陰離子交換，pH保持在7-11的范圍內(nèi)。所選的pH值必須支持目標(biāo)分析物與固定相的結(jié)合，并且應(yīng)接近其pI值，以便其可以從色譜柱中釋放出來(lái)。在非常低或非常高的pH值下，分析物，尤其是蛋白質(zhì)，可能會(huì)牢固地結(jié)合到固定相上，這需要高鹽濃度來(lái)洗脫。此外，一些蛋白質(zhì)可能在高pH值和高鹽濃度下沉淀或失去活性。對(duì)于陰離子交換和陽(yáng)離子交換色譜，起始緩沖液的pH值應(yīng)分別高于或低于目標(biāo)分析物的pI  0.5至1 pH單位。必須仔細(xì)優(yōu)化起始緩沖液的濃度，以確保有效分離。離子強(qiáng)度/鹽濃度-通常用含有高達(dá)300至500 mM鹽(如氯化鈉、、、硫酸鈉或乙酸鈉)的緩沖液進(jìn)行洗脫。


　　添加劑——如有必要，可添加尿素、糖或去污劑等添加劑，以增加分析物的溶解度，防止其沉淀或通過(guò)抑制酶活性來(lái)確保分析物的穩(wěn)定性。然而，添加劑可能在工作pH值下帶電，從而干擾分離。


　　樣品制備-由于緩沖液的pH值決定了分子的電離狀態(tài)，因此樣品緩沖液的pH值保持在高于或低于目標(biāo)分析物pI值0.5至1.5個(gè)pH單位。這確保了分子對(duì)于陰離子交換或陽(yáng)離子交換色譜是適當(dāng)帶電的。雖然緩沖液的選擇取決于樣品基質(zhì)，但起始緩沖液樣品制備。如果使用不同的緩沖液，可以在分析前將其與起始緩沖液交換。高離子強(qiáng)度溶液中的樣品可以在裝載前用起始緩沖液稀釋，只要它不含污染物，如洗滌劑。粘性樣品難以取樣和分離；這些必須用起始緩沖液稀釋。除pH值外，樣品緩沖液的離子強(qiáng)度對(duì)獲得良好的分離度也起著重要作用。因此，有必要對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽處理，并用起始緩沖液替換其緩沖液。在將樣品裝入色譜柱之前，必須過(guò)濾樣品以去除顆粒。


　　上樣-為了獲得分離度，分析物的質(zhì)量不應(yīng)超過(guò)制造商推薦的色譜柱的結(jié)合能力。

　　梯度必須優(yōu)化運(yùn)行時(shí)間和離子強(qiáng)度隨時(shí)間變化的百分比，以達(dá)到所需的分離度。一般來(lái)說(shuō)，階梯式pH梯度優(yōu)于線性pH梯度，因?yàn)楹笳唠y以精確和重復(fù)地產(chǎn)生。

　　——分辨率不受影響的流速可用于提高通量。在色譜柱再生和再平衡過(guò)程中，可以使用更高的流速以節(jié)省時(shí)間。

　　雖然IEX有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，但它也有一些局限性(表2)，在選擇該技術(shù)進(jìn)行生物分子的分離、純化或定量時(shí)必須考慮這些因素。