用于牛奶中抗生素分析的液相色譜質譜聯用儀

       磺胺類藥物通常被稱為“磺胺類藥物”——磺胺類的衍生物（對氨基苯磺胺）。由于其抗菌性強、成本低、毒性低，常被用作獸醫治療常見細菌性疾病的抗菌藥物。獸藥的無節制使用和不遵守停藥期可能導致治療后藥物殘留在動物組織中。這些殘留物可以通過動物的乳汁傳染給人類。通常的做法是對奶牛使用各種抗生素進行不同的治療，但這最終會導致抗生素殘留物在牛奶中積累，當人類食用時會引起過敏反應和毒性作用。


      歐盟監管機構發布了一系列文件，旨在更好地規范獸藥的控制以保護消費者。理事會指令96/23/EC7概述了對食用動物中獸藥殘留的控制。


      在印度，FSSAI（2018年7月20日公報）和EIC（用于水產養殖、雞蛋、蜂蜜、奶牛等的RMP）要求對抗生素進行早期和頻繁的分析。EIC和FSSAI已經為動物食品基質中常見的一系列特定抗生素殘留建立了殘留(MRL)。檢測牛奶中的磺胺類藥物殘留對于維護消費者安全和防止他們接觸獸藥至關重要。本文概述了一種快速靈敏的LC-MS/MS方法，用于定量分析牛奶中的磺胺類抗生素。

實驗性的硬件和軟件

PerkinElmer LX-50 UHPLC 系統用于色譜分離，同時通過配備 ESI 和 APCI 電離源的 PerkinElmer QSight™ 220 三重四極桿質譜儀進行檢測。

儀器控制、數據采集和數據處理均使用 Simplicity 3Q™ 軟件在一個窗口中進行。表 1 提供了 LC 參數，包括色譜柱和流動相梯度程序。

表 1. UHPLC 參數。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質量

液相色譜柱	Univ C18AQ 100 mm X 3 mm X 2.1μm (P/N N9304784)
流動相 A	0.1% 甲酸水溶液
流動相 B	0.1% 甲酸的乙腈溶液
流動相梯度	先生號 時間 ％一種 %B 1 0.00 98 2 2 1.50 98 2 3 6.00 4 96 4 6.50 4 96 5 7.00 98 2 6 7.50 98 2
柱溫箱溫度	40oC
自動進樣器溫度	15℃
注射量	10 微升
流動	0.5 毫升/分鐘
運行	7.5 分鐘
ESI 電壓 (+Ve)	5300
干燥氣體	110
霧化器氣體	300
源溫度	300
HSID 溫度	220

材料:試劑和化學品
所有 CRM、試劑和化學品均為 NIST 可溯源和 LC-MS/MS 級。該研究還使用了 1 型水。


方法
儲備溶液和校準標準品的制備
用 10 mg/L 所有分析物的 10 mL 標準混合物制備儲備溶液。這是通過從母液到 10 mL 容量瓶的適當體積來實現的，然后為每種抗生素分析物使用適當的溶劑。

標準溶液均保存在 -20 oC。通過用水:乙腈 (80:20, v/v) 連續稀釋儲備溶液的工作溶液 (5, 10, 25, 50, 100 和 200 ng/ml) 制備校準標準品。


樣品提取程序

將總共?? 2 g ± 0.1 g 的樣品稱重到 50 mL PTFE 離心管中。
在將其在渦流中搖動30秒并放置30分鐘之前，添加總共4mL的水。
總共加入 10 mL 乙酸乙酯，然后將其在渦旋中搖動 2-3 分鐘，以確保溶劑和分析物的適當相互作用。
將樣品以 10000 rpm 離心 10 分鐘。
將總共?? 5 mL 上清液加入到蒸發管中，并在 40 oC 的氮氣蒸發器下蒸發至干。
樣品用 1 mL 乙腈:水 (80:20, v/v) 復溶并渦旋。
然后通過 0.2 µm 濾紙過濾樣品。
結果與討論
線性研究通過六個校準點涵蓋 5 µg/L 至 200 µg/L 的濃度水平。該方法對牛奶基質中研究的所有抗生素均表現出出色的線性，R 2 >0.99。所有抗生素的定量限 (LOQ) 均達到 10 µg/L。

表 2.基質效應。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質量

分析物	溶劑標準區。	矩陣匹配區域。	％ 我
磺胺甲氧基吡啶	50655	80960	60
	38731.8	43709	13
	10873.6	43955.7	304
	18719.4	56815	204
	76718.8	122715	60
	72406.6	111414.3	54
磺胺異惡唑	94119.2	154994.2	65
磺胺喹惡唑	30548.2	37611.5	23
磺胺喹喔啉	29353	37376	27

表 3.分析物的 MRM 離子對和保留時間。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質量

分析物	前體	產品一	行政長官 1	產品 2	行政長官 2	逆轉錄
磺胺甲氧基吡啶	281	156	-23	65	-78	3.68
	256	156	-20	65	-73	6.07
	251	156	-22	108	-34	3.08
	250	156	-22	184	-23	3.24
	271	156	-19	92	-41	3.50
	285	156	-20	108	-38	3.76
磺胺異惡唑	268	156	-19	113	-20	3.95
磺胺喹惡唑	301	156	-23	92	-48	4.15
磺胺喹喔啉	301	156	-23	208	-25	2.15

基質效應
將基質匹配標準品的響應（萃取前加標的峰面積）與溶劑中標準品的相應峰面積進行比較。這是在六次重復中完成的。

該程序允許使用基質標準的面積和溶劑標準的面積（表2）將基質效應（ME）量化為峰面積的平均抑制或增強百分比。負ME值表示矩陣誘導的信號抑制，而正值表示信號增強。

恢復研究
所有化合物的回收率通過在10、25和50µg/kg水平上加標6次重復的牛奶樣品來確定。

發現所有分析物的回收率都在80%和120%之間，而所有化合物的RSD百分比均低于20%-符合法規要求的可接受值。

表4、5和6代表三次回收率和回收率以及RSD。完成最終稀釋因子的計算后，重復分析六次數據。

表 4. 10 μg/kg 加標時的回收率，實際加標時稀釋 5 倍。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質量

分析物	建議 1	建議 2	建議 3	建議 4	建議 5	建議 6	平均	標準差	%RSD	％ 恢復
磺胺甲氧基吡啶	10.73	10.61	10.61	10.00	10.60	10.89	10.57	0.30	2.88	105.72
	10.60	9.39	8.98	7.92	6.88	7.73	8.58	1.34	15.58	85.83
	9.51	8.84	9.38	10.97	10.10	9.16	9.66	0.76	7.92	96.60
	10.05	8.33	9.54	10.55	8.86	9.56	9.48	0.80	8.42	94.81
	10.25	9.88	9.95	9.28	9.10	8.94	9.57	0.53	5.52	95.65
	10.86	10.27	10.75	10.06	10.48	10.54	10.49	0.30	2.83	104.94
磺胺異惡唑	10.29	10.39	10.08	9.81	9.81	9.93	10.05	0.25	2.45	100.53
磺胺喹惡唑	10.42	10.31	10.39	9.27	9.19	9.92	9.92	0.56	5.64	99.16
磺胺喹喔啉	10.41	10.35	10.71	9.67	9.81	10.63	10.26	0.43	4.19	102.64

分析物建議 1建議 2建議 3建議 4建議 5建議 6平均標準差%RSD％ 恢復磺胺甲氧基吡啶26.0026.8426.0719.4318.88