熒光定量PCR儀其操作前期的準備工作

來源：北京眾力挽生物科技有限公司 2025年07月23日 07:27

　　熒光定量PCR儀是一種用于分子生物學檢測的高靈敏度、高特異性的分析儀器。通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR（聚合酶鏈式反應）產物進行標記和跟蹤，實時監測反應過程中的熒光信號變化。在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。隨著反應循環數的增加，目標DNA的擴增會導致熒光信號的增強。通過檢測熒光信號的變化，可以繪制出熒光強度相對于循環數的擴增曲線，從而實現對靶DNA的定量分析。

　　熒光定量PCR儀的前期準備工作：

　　1、樣品準備

　　核酸提取：從樣本（如組織、細胞、血液等）中提取DNA或RNA。提取過程中要嚴格按照相應的盒說明書操作，以確保核酸的純度和完整性。例如，使用柱式提取法時，要注意細胞裂解的充分性、結合條件的控制以及洗脫液的用量和溫度等因素。

　　樣品鑒定與定量：對提取的核酸進行質量和濃度檢測。可以使用分光光度計測定核酸的濃度，通過A260/A280比值來判斷核酸的純度（純DNA或RNA的A260/A280比值一般在1.8-2.0之間）。同時，利用瓊脂糖凝膠電泳等方法來鑒定核酸的完整性，確保沒有明顯的降解。

　　稀釋樣品：根據熒光定量PCR的檢測范圍和樣品中目標核酸的濃度，將樣品稀釋到合適的濃度。如果樣品濃度過高，可能會導致PCR反應過早進入平臺期，影響定量結果的準確性；如果樣品濃度過低，則可能無法檢測到足夠的信號。

　　2、引物和探針設計

　　引物設計：根據目標基因的序列信息，設計特異性的引物。引物的長度一般在18-25個堿基對之間，GC含量在40%-60%之間。引物的3'端應避免連續的G或C，且不能有互補序列，以防止引物二聚體的形成。可以使用專業的引物設計軟件（如Primer3、OligoPerfect等）來進行設計，并通過BLAST等工具驗證引物的特異性。

　　探針設計（對于使用探針法的情況）：熒光探針的設計要考慮其與目標序列的特異性結合和熒光標記的穩定性。探針的長度通常在15-30個堿基之間，熒光基團和淬滅基團的選擇要根據儀器的檢測通道來確定。例如，常見的熒光基團有FAM（用于檢測綠色熒光）、VIC（用于檢測黃色熒光）等，淬滅基團有TAMRA、BHQ等。

　　3、試劑準備

　　PCR反應混合液：按照試劑盒說明書配制PCR反應混合液。一般包括緩沖液、dNTPs（三磷酸脫氧核苷）、引物、探針（如果使用）、Taq DNA聚合酶（或其他合適的DNA聚合酶）等。在配制過程中，要注意各種試劑的比例和添加順序，確保混合均勻。

　　模板添加：將稀釋后的樣品（DNA或RNA）加入到PCR反應混合液中。加入的體積要根據PCR反應體系的總體積和樣品濃度來確定，通常每管反應體系中加入1-5μL的樣品。

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