DAP-seq助力揭示多年生黑麥草轉錄因子LpNAC22增強耐旱性的分子機制

2025年6月10日，西北農林科技大學秦濤教授團隊在Plant, Cell & Environment發表了題為“NAC Transcription Factor LpNAC22 Positively Regulates Drought Tolerance in Perennial Ryegrass”的研究論文。該研究從多年生黑麥草中分離出干旱誘導的NAC轉錄因子LpNAC22，借助DAP-seq系統解析了LpNAC22通過調控LEA家族基因增強耐旱性的分子機制，為牧草抗旱分子育種提供了關鍵理論依據與基因靶點。

研究背景

多年生黑麥草是全球溫帶地區廣泛使用的牧草和草坪草，但對干旱敏感，缺水會導致生長、turf質量和生產力下降。植物通過分子和生理機制抵抗干旱，其中轉錄因子（如NAC）起重要調控作用。盡管NAC在多種植物中被證明與耐旱相關，但多年生黑麥草中NAC的耐旱調控機制尚不明確。

技術路線

研究結果

作者從多年生黑麥草中分離出13個與NAC轉錄因子高度同源的編碼序列，其中LpNAC22在干旱脅迫后轉錄水平更高，且在高抗旱性品種中表達量顯著高于低抗旱性品種。系統發育分析顯示其與多個干旱響應型NAC蛋白屬于同一亞組。亞細胞定位表明LpNAC22定位于細胞核，轉錄活性分析顯示其具有轉錄激活功能，且轉錄激活區域位于C端（138-331氨基酸）。

圖1. LpNAC22轉錄因子的基因表達分析與系統發育關系。

圖2. LpNAC22的亞細胞定位與轉錄活性分析。

作者接著研究了LpNAC22在調控多年生黑麥草耐旱性中的功能。干旱處理誘導LpNAC22表達后，其在擬南芥和多年生黑麥草中過表達均能提高植株存活率、相對含水量和葉綠素含量，降低丙二醛含量、離子滲漏和活性氧積累，減輕細胞損傷，增強耐旱性。進一步構建了兩個突變株系（Ri2和Ri3），干旱處理前突變株系與野生型植株表型和生理指標無差異；但干旱處理后，突變株系存活分蘗率、株高、干重、相對含水量和葉綠素含量均低于野生型，離子滲漏率、丙二醛含量及活性氧積累則高于野生型，表明LpNAC22突變會導致細胞膜損傷加劇。以上結果表明，LpNAC22在多年生黑麥草抗旱性調控中起正向作用。

圖3. LpNAC22過表達增強了轉基因多年生黑麥草的耐旱性。

圖4. LpNAC22基因突變削弱多年生黑麥草的干旱處理耐受性。

為探究LpNAC22調控抗旱性的機制，作者通過DAP-seq分析，發現9165個啟動子片段被富集，覆蓋5195個基因。GO富集分析表明其中富集多種脅迫響應基因，包括水分剝奪相關基因。值得注意的是，8個LEA家族基因的啟動子區域在DAP-seq結果中呈現顯著富集，結合生理實驗中LpNAC22過表達植株細胞膜損傷減輕的表型（MDA含量降低、離子滲漏減少），推測LpNAC22可能通過調控LEA基因表達保護細胞膜以增強抗旱性。進一步通過酵母單雜交（Y1H）實驗驗證發現，LpNAC22能特異性結合LpLEA1和LpLEA2-1的啟動子片段，并激活LacZ報告基因表達。后續經ChIP-qPCR、EMSA及熒光素酶報告基因實驗多維度驗證，證實LpNAC22可直接結合上述LEA基因啟動子并激活其轉錄。

圖5.LpNAC22直接調控LpLEA1和LpLEA2-1的表達水平。

大量研究表明膜穩定是LEA蛋白響應干旱脅迫的主要機制。本研究發現，干旱處理可誘導LpLEA1和LpLEA2-1表達，且其編碼蛋白定位于細胞膜，暗示二者可能在干旱下維持膜完整性。因未能獲得過表達這兩個基因的轉基因多年生黑麥草，故用擬南芥轉基因株系分析表型。結果顯示，干旱條件下野生型多數萎蔫，而過表達株系存活率更高，離子滲漏率和MDA含量更低。這些結果表明，LpLEA1和LpLEA2-1能減輕細胞膜損傷，增強植株抗旱性。

圖6. LpLEA1和LpLEA2-1的過表達可緩解干旱條件下植物細胞膜的損傷。

研究結論

本研究鑒定了多年生黑麥草中的干旱誘導型核轉錄激活因子LpNAC22，證實其通過直接調控LEA家族基因LpLEA1和LpLEA2-1的表達來增強植物的耐旱性，為多年生黑麥草的耐旱分子育種提供了重要的基因資源和理論依據。