RBP研究技術RIP-seq+Polysome profiling

【RNA結合蛋白ARID5A驅動IL-17依賴性自身抗體誘導的腎小球腎炎】

自身抗體介導的腎小球腎炎（AGN）是由腎臟炎癥失調引起的重大健康問題，盡管現有的治療方法可以提高生存率，但效果有限，而且副作用嚴重。因此，迫切需要改進的治療方法。IL-17在AGN中的作用已被廣泛研究，但其下游的分子信號以及調控機制仍不清楚。最近研究發現，RNA結合蛋白ARID5A(AT-rich interactive domain-containing protein 5a)在AGN中顯著上調，并在IL-17依賴性腎臟炎癥中發揮關鍵作用。

文章題目：The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis

發表期刊：Journal Of Experimental Medicine

科研團隊：美國匹茲堡大學醫學系、免疫學系等

發表時間：2024年7月26日

主要發現

1. ARID5A在AGN中起關鍵作用：ARID5A通過調控IL-17依賴性炎癥反應，驅動AGN的病理過程。

2. ARID5A的翻譯調控功能：ARID5A通過與核糖體相互作用，增強關鍵炎癥轉錄因子（如C/EBPs）的翻譯，從而促進AGN的發展。

研究意義

該研究揭示了ARID5A在IL-17依賴性腎臟炎癥中的重要作用，為開發針對AGN的新型治療策略提供了潛在靶點。通過選擇性抑制ARID5A，可能在不影響宿主防御的情況下，有效控制自身免疫性腎臟疾病。

研究結果

1.ARID5A在人類和小鼠AGN中表達升高

ARID5A在人組織中的表達：分析歐洲腎臟cDNA數據庫（European Renal cDNA Bank）發現IL17RA mRNA在多種AGN中表達升高。類似地ARID5A mRNA也在多種AGN（如IgA腎病、ANCA相關性腎炎等）中顯著上調。采用RNAScope原位雜交對腎組織進行活檢，結果表明在ANCA-GN患者中ARID5A的表達也顯著升高。

ARID5A在小鼠中的表達：在Act1缺失小鼠（Act1^?/?）的腎組織中ARID5A的誘導減弱，以及IL-17特征減少，因此ARID5A的誘導依賴于IL-17信號通路。與ANCA-GN患者類似，在AGN期間的腎小管上皮細胞（RTECs）中ARID5A的表達顯著上調。因此，ARID5A主要在AGN期間的IL-17應答性腎臟細胞中高表達。

圖1. AGN期間ARID5A在人和小鼠腎上皮中表達升高。

2.ARID5A能夠增強AGN病理

腎功能保護：ARID5A缺失的小鼠誘導AGN后，腎功能指標（如血尿素氮BUN和肌酐）顯著低于野生型小鼠，表明ARID5A缺失能夠保護腎臟免受AGN的損害。

炎癥反應減弱：ARID5A缺失小鼠的腎臟中，IL-17依賴性炎癥因子（如IL-6、Lcn2、Ccl2等）的表達顯著降低，且髓系細胞（如單核細胞和巨噬細胞）的浸潤也明顯減少。

組織病理學改善：ARID5A缺失小鼠的腎臟組織病理學評分顯著改善，異常腎小球的數量減少，表明ARID5A在AGN的病理過程中起關鍵作用。

圖2. ARID5A對于AGN是必需的。

3.ARID5A調控C/EBP轉錄因子的蛋白積累

C/EBP轉錄因子的表達：在AGN模型中，C/EBPβ和C/EBPδ的mRNA水平在ARID5A缺失小鼠中并未顯著變化，但其蛋白水平顯著降低。這表明ARID5A主要通過調控C/EBP轉錄因子的翻譯而非轉錄來影響其表達。

IL-17誘導的C/EBP蛋白積累：在體外實驗中，IL-17刺激后，ARID5A缺失的RTECs中C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平顯著降低，進一步證實了ARID5A在IL-17依賴性C/EBP蛋白積累中的關鍵作用。

圖3. ARID5A調控C/EBP轉錄因子。

4.ARID5A結合的RNA靶點鑒定

RIP-Seq分析：通過RNA免疫沉淀測序（RIP-Seq），研究人員發現ARID5A在IL-17刺激后與多種RNA結合，其中包括炎癥相關mRNA（如CEBPD、NFKBIZ）以及核糖體RNA（rRNA）和翻譯相關RNA。

圖4. 鑒定RTECs中ARID5A靶標轉錄本。

5.ARID5A與核糖體相互作用，促進蛋白質翻譯

ARID5A與核糖體的相互作用：嘌呤霉素摻入實驗表明ARID5A以某種方式促進翻譯。通過蔗糖梯度離心（Polysome profiling）和免疫印跡分析，研究人員發現ARID5A主要與40S核糖體亞基結合，而在60S和80S核糖體中的結合較弱，表明ARID5A可能在翻譯起始階段發揮作用。熒光共聚焦成像顯示IL-17依賴的ARID5A與核糖體共定位。此外，IL-17促進ARID5A從細胞核輸出到細胞質，并與40S核糖體亞基（18S rRNA）結合。ARID5A還與60S核糖體亞基（5S rRNA）有較弱的相互作用，表明ARID5A可能在翻譯起始過程中發揮動態作用。

全局翻譯調控：ARID5A缺失的細胞中，全局蛋白質合成顯著減少，表明ARID5A在維持細胞翻譯活性中起重要作用。

炎癥因子的翻譯增強：IL-17刺激后，ARID5A通過與核糖體結合，增強了C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率，從而促進了AGN的病理過程。

圖5. Arid5a促進RTECs中的蛋白質合成。

ARID5A功能在ST2細胞中的驗證：在IL-17敏感的ST2細胞中，ARID5A同樣表現出與核糖體的相互作用，并調控炎癥因子的翻譯。RIP-Seq分析顯示，ARID5A在ST2細胞中結合的RNA靶點與HK-2細胞中的結果高度一致，進一步驗證了ARID5A在IL-17信號通路中的保守功能。

圖6. Arid5a結合rRNA，促進小鼠基質細胞中的蛋白質合成。

ARID5A在AGN中的病理機制模型：IL-17刺激后，ARID5A從細胞核輸出到細胞質，與40S核糖體亞基結合，增強C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率。這些炎癥因子進一步促進腎臟炎癥和AGN的病理過程。

圖7. Arid5a的作用模型。

研究小結

這項研究揭示了ARID5A在IL-17依賴性腎臟炎癥中的關鍵作用，特別是通過調控C/EBP轉錄因子的翻譯來驅動AGN的病理過程。ARID5A的發現為開發針對AGN的新型治療策略提供了潛在靶點，尤其是通過選擇性抑制ARID5A來阻斷IL-17信號通路，可能在不影響宿主防御的情況下有效控制自身免疫性腎臟疾病。

參考文獻

Yang Li, Shachi P Vyas, Isha Mehta, et al. (2024). The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis. Journal of Experimental Medicine, 221(9), e20240656. doi:10.1084/jem.20240656

RBP研究方案設計：RIP-seq + Polysome profiling

1. 研究背景

RNA結合蛋白（RBP）在轉錄后調控中起關鍵作用，影響RNA的穩定性、定位、翻譯和降解。RIP-seq（RNA免疫共沉淀測序）和Polysome Profiling（多核糖體分析）聯合使用，可全面研究RBP與RNA的相互作用及其對翻譯的影響。

2. 研究目標

1)     鑒定特定RBP結合的RNA分子。

2)     分析RBP對RNA翻譯效率的影響。

3)     探索RBP在轉錄后調控中的機制。

3. 實驗設計

3.1 實驗材料

1)     細胞系：選擇目標RBP高表達的細胞。

2)     抗體：針對目標RBP的特異性抗體。

3.2 實驗步驟

3.2.1 細胞培養與處理

1)     培養目標細胞至對數生長期。

2)     根據實驗需求處理細胞（如藥物處理、基因敲除/過表達等）。

3.2.2 RNA免疫共沉淀（RIP）

1)     細胞裂解：收集細胞，使用裂解緩沖液裂解。

2)     免疫沉淀：加入RBP特異性抗體，孵育后與蛋白A/G磁珠結合，捕獲RBP-RNA復合物。

3)     洗滌：洗滌磁珠，去除非特異性結合。

4)     RNA提取：解離RBP-RNA復合物，提取RNA。

3.2.3 Polysome Profiling

1)     細胞裂解：收集細胞，使用裂解緩沖液裂解。

2)     蔗糖梯度離心：制備蔗糖梯度，超速離心分離多核糖體。

3)     分部收集：收集不同密度的多核糖體組分。

4)     RNA提取：從各組分中提取RNA。

3.2.4 RNA-seq

1)     RNA質量檢測：檢測RNA質量。

2)     建庫：使用RNA-seq建庫試劑盒構建測序文庫。

3)     測序：進行高通量測序（如Illumina平臺）。

3.2.5 數據分析

1)     數據預處理：去除低質量reads和接頭序列。

2)     比對：將reads比對到參考基因組。

3)     差異表達分析：比較RIP-seq和Polysome Profiling數據，識別RBP結合的RNA及其翻譯效率變化。

4)     功能注釋：對差異表達的RNA進行GO和KEGG通路分析。

4. 預期結果

1)     鑒定出RBP結合的靶RNA。

2)     分析RBP對RNA翻譯效率的影響。

3)     揭示RBP在轉錄后調控中的潛在機制。

5. 研究意義

1)     全面解析RBP的功能及其對RNA翻譯的調控機制。

2)     提供RBP在轉錄后調控中的新見解。

3)     為相關疾病機制研究和治療靶點開發提供依據。